神经生物学常用研究方法PPT课件

.,1,神经生物学常用研究方法,王海萍(histologyw)安徽医科大学神经生物学教研室,.,2,神经科学的兴起,中国内经（汉或秦）：脑为诸髓之海国外：医学之父希波克拉底（Hippocrates，460377BC.）提出脑是精神活动的器官;而古罗马医学家盖伦则认为,脑是理性灵魂的器官,感觉、记忆、思维、想象、判断等都是脑的功能；德国医生加尔指出脑是思想的器官“颅相学”,盖伦（129-200）：医学上的权威仅次于希波克拉底，他认为人体具有三种灵魂，即（一）生长灵魂，这是人、动物和植物所共有的，在人体它位于脐部；(二）动物灵魂，这是人和动物所共有的，它位于心脏、主管感觉和运动；(三）理性灵性灵魂，这只有人才具备,位于脑部，主管智慧。,希波克拉底（公元前460-377）：被西方尊为“医学之父”的古希腊著名医生，欧洲医学奠基人，古希腊医师，西方医学奠基人。提出“体液(humours)学说”，认为人的体液由血液、粘液、黄胆和黑胆组成；破除巫术和宗教对医学的禁锢，医病人，而不是病；提出大脑是神经系统的中心，批评亚里斯多德关于心脏是思维器官的说法,加尔（19世纪初）：德国的解剖学家，专门从事颅骨和脑的研究。颅相学指分析人的心理与头颅形状之间关系的理论学说。加尔从小就喜欢观察人的外表（尤其是颅骨外表）同心理的关系。例如，他根据个人长期的个案观察，发现眼睛明亮的人，一般记忆力较好；头骨隆起的人，可能象征着贪婪的脑机能，是监狱中扒手的特征等。根据当时生理和解剖知识，写了一套名为神经系统的解剖学和生理学的系列著作，除了就神经系统及其机能进行严谨、保守的阐述之外，还兼论颅相学。,神经科学(1990-2000脑的十年)(2001-2100脑的世纪),生命科学,解剖学生理学生物化学,认知科学（人类感知和思维信息处理过程的科学）,开发脑开发人脑增强智能模拟人脑智能电脑,保护脑寿命延长PD,AD,中风高速交通颅脑,脊髓外伤生活节奏焦虑,抑郁,精神病生活质量镇痛祛痛社会开放吸毒问题,了解脑分子细胞网络全脑(离体研究)(无创在体研究)Patch（电）脑地形图RIA(化学）PET(化学）PCR(基因）fMRI(功能）ConfocalCT(形态）(形态）行为变化,百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介(I),C.S.Sherrington(英),1857,1850,1900,1950,2000,C.Golgi(意),1926,1934,神经元染色方法,1843,1852,R.Cajal(西班牙),“神经元学说”,形态,1906,1952,1932,“突触”定名“反射”概念“交互”抑制,反射学说,1889,1977,感觉神经纤维电活动传入冲动大脑诱发电位神经控制骨骼肌运动机制,E.D.Adrian(英),电生理,O.Loewi(德英),1961,1873,1936,蛙心灌流实验“迷走物质”,1968,1875,H.Dale(英),神经末梢分泌乙酰胆碱ACh,神经化学,1874,1965,1944,1963,1888,J.Erlanger(美),H.S.Gasser(美),阴极射线示波器神经纤维的分类ABC,1973,1881,W.R.Hess(瑞士),脑立体定位仪hypothalamus,方法学创新,1949,电生理,Oxf,Cambridge,徒手切脑片银染神经元,染出神经末梢，发现神经元之间无原生质联系,巴浦洛夫（1904）,百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介(II),神经药理学,分子药理学,1850,1900,1950,2000,J.C.Eccles(澳大利亚),1914,1903,1963,A.L.Hodgkin(英),B.Katz(德英),1917,A.F.Huxley(英),细胞内微电极突触后电位抑制性递质,突触,电压钳技术动作电位的离子学说数学方程表述,NM终板电位递质“量子释放”,1911,动作电位机制,1905,1983,U.VonEuler(瑞典),交感神经递质去甲肾上腺素,1970,儿茶酚胺代谢影响CAs的药物,电生理,1912,J.Axelrod(美),（儿茶酚胺）,神经化学,1913,(左右脑),R.W.Sperry(美),1981,“脑功能侧化”,D.Hubel(加美),1926,1924,T.Wiesel(瑞典美),信息加工,视皮层,E.Neher(德),1991,B.Sakmann(德),大脑视觉信息加工视觉系统发育的可塑性,膜片钳技术单个离子通道电流记录,1999,英，澳,Cambridge,Cambridge,LeviMontalcini1986NervegrowthFactor(NGF)(Italy),百年来与神经科学有关的诺贝尔奖获得者选介(3),1850,1900,1950,2000,1926,1923,2000,P.Greengard(美),1930,E.Kandel(美),A.Carlsson(瑞典),神经系统中的信号转导,蛋白磷酸化慢突触传递多巴胺,生理科学进展2001年第32卷第2期,2004年诺贝尔生理学或医学奖颁发给美国科学家理查德阿克塞尔和琳达巴克，以表彰他们在人体气味受体和嗅觉系统组织方式研究中作出的杰出贡献。,.,10,神经科学的特点,多学科综合,神经科学的特点,多层次的研究,.,12,研究水平,整体行为水平：行为学，躯体感觉，视听觉，痛觉等细胞水平：神经细胞培养、生物电活动检测、通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测分子水平的实验：离子通道、受体、酶、遗传物质等,.,13,神经生物学常用研究方法,形态学方法大体：解剖、影像组织：常规染色和特殊染色、束路追踪、免疫组化、原位杂交、神经细胞培养等生理学方法生物化学方法分子生物学方法,.,14,神经影像（Neuroimaging）,Invasive:SingleunitrecordingMulti-unitrecordingPET(positronemissiontomography),Non-invasive:CT(computedtomography)ERP(event-relatedpotential)MEG(magnoencephalography)MRI(magneticresonanceimaging)fMRI(functionalmagneticresonanceimaging),.,15,ChoiceoftheMethods,Choiceofthemethodsdependsonthescientificquestionbeingasked.Forneuronalactivity,atacellularlevel,usesingle-ormulti-unitrecording.Forquestionsofstructure,useCTorMRI.Forquestionsoffunction,orsysteminteractions,wheretheanatomyisofinterest,usePETorfMRI.Forquestionsofprocessing,wheretimingisimportant,useERPand/orMEG.,.,16,Single-&Multi-unitRecording,Invasive:implantinganelectrodeintothebrainPassive:recordingtheactivity(actionpotentials)ofoneormoreneurons,notstimulatingactivityUsuallyonlydonewithanimalsorpeoplerequiringneurosurgery,.,17,PositronEmissionTomography(PET，正电子发射计算机断层显像),O15Water,FDGorF18fluorodeoxyglucose,18F-FDGPET脑代谢显像，正常人与老年性痴呆对照，患者双侧顶叶、颞叶皮质对称性低代谢。,18F-DOPAPET脑受体显像，正常人与帕金森氏病脑纹状体多巴胺受体密度影像对照，患者双侧纹状体密度明显减少,.,19,CTorCATscan(ComputedTomography),Magnetoencephalography(脑磁波描计术，MEG),151ChannelMEG,CurrentflowinneuronscreateslocalmagneticfieldsMEGmeasureslocalmagneticfieldchangesfromthesurfaceofthescalpusingsuperconductingcoilsorSQUIDsExcellenttemporalresolutionBetterspatialresolutionthanERP,.,21,MRIvsMEG,.,22,MagneticResonanceImaging(MRI),fMRI(functionalmagneticresonanceimaging),Brainactivity,Oxygenconsumption,Cerebralbloodflow,OxyhemoglobinDeoxyhemoglobin,Magneticsusceptibility,T2*,MRIsignalintesity,.,24,组织学与细胞学,常规染色和特殊染色束路追踪免疫组化原位杂交神经细胞培养等,.,25,常用普通染色方法,TTC染色HE锇酸染色氯化金浸染Cajal银浸染色尼氏染色,.,26,HE（苏木素伊红）,.,27,锇酸染色是神经科学研究的一种常用而普遍的方法，它本来是用来固定脂质的，由于髓鞘的主要成分是脂质，所以用于有髓神经纤维的染色,锇酸染色,.,28,氯化金浸染,运动终板,Ach荧光染色,氯化金浸染,.,29,Cajal银浸染色,.,30,尼氏染色,多种方法，HE、甲苯胺蓝，焦油紫，硫堇，天青，派洛宁，中性红以及棓花青等碱性苯胺染料均可以使尼氏体着色,.,31,束路追踪,原理：轴浆运输示踪物质：HRP，荧光染料，各种标记物标记的葡萄糖，放射性核素标记的氨基酸等。观察：根据示踪物质不同，采用组织显色、荧光显微镜或放射自显影等方法。,免疫组化,原理示意图：间接法：直接法：,.,33,免疫组化,根据二抗标记的不同（荧光素、酶、铁蛋白、胶体金或银标记），免疫组化包括免疫荧光、免疫酶组织化学、免疫金银及铁标记技术,.,34,原位杂交,核酸分子杂交技术，检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。,.,35,原位杂交,此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA)；应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针(cDNA)；依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA的常用标记物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。,.,36,原位杂交,组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达。核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调节机制的，已成为当前神经生物学研究的重要手段。,.,37,生理学方法,最常用的有两种神经行为学电生理学,.,38,一、神经行为学,Behavioralneuroscienceisthestudyoftheneuralmechanismsmediatingnormalandabnormalbehaviors.自主活动动物焦虑检测：实施焦虑因素，如饮食或饮水剥夺，检测反应，可以用于药物筛选。性和生殖行为：进化，神经内分泌作用机制学习记忆摄食行为惊恐反射社会行为.,.,39,自主活动箱实验,动物的自主活动标志着动物中枢神经系统的兴奋状态，当中枢神经系统兴奋时，自主活动加强，抑制时则自主活动减少。观察动物自主活动是评价中枢神经兴奋状态的一项主要指标。多种作用于中枢神经系统的药物都可影响动物的自主活动，因而自主活动的记录是研究中枢神经系统药物的主要方法，而且在新药研究中，观察药物对动物自主活动的影响也是评价药物是否影响中枢神经系统的重要方法,.,40,自主活动箱实验,主要技术指标：运动次数,.,41,洞板实验,.,42,学习记忆的行为学检测,学习记忆功能包括空间学习记忆功能和非空间学习记忆功能。随着对大脑学习记忆机制研究的不断深入以及寻找有效防治认知障碍类疾病方法的需要，使得动物行为学实验成为研究脑高级功能及其他神经科学的不可缺少的重要手段，客观准确地评价实验动物的学习记忆水平已成为神经生物学和神经药理学中非常重要的研究内容。,学习记忆功能检测的常用实验程序,.,44,Morris迷宫,1981年，英国心理学家Morris首次设计应用了这种水迷宫及其程序。目的是帮助大脑学习记忆机制的研究。起初实验动物主要为大鼠，此后该迷宫系统成为评估啮齿类动物空间学习和记忆能力的经典程序，广泛运用于神经生物学、药学等领域的基础和应用研究中。,Morris水迷宫,应用:判断动物空间学习记忆能力组成:,观察指标:潜伏期，路径，不同象限的停留时间和长度，搜索策略等,.,46,Morris水迷宫,.,47,.,48,Morris水迷宫,原理水是啮齿类动物非常厌恶的刺激或环境。鼠在水池中就会急于寻找逃路。它们的习性为在水池四周寻找出口逃避，但深而光滑的垂直池壁阻碍了这种企图。实验中设置的水下平台（用于小鼠的常为水面下1cm）可提供鼠栖身的场所。但在巨大的水面上，强迫游泳的动物不能看见平台。它们若要快速找到平台而避免淹没就必须利用环境中的线索进行定位。从而检测了鼠记住环境中的线索及其与平台位置关系而对平台进行定位的能力（学习记忆能力）。,Morris水迷宫的优点及不足,由于对年龄相关性空间记忆损害有可靠的敏感性，Morris水迷宫是判断老年小鼠空间学习记忆能力的特别有用的工具。驱动动物逃避的是水刺激，而不需要食物和水的剥夺。因此，避免了剥夺食物和水后给实验动物带来的新陈代谢方面的问题。动物不必接受电休克，这在那些食欲促进任务（appetitivetasks）如辐射状迷宫和T迷宫中是常规的要求。能提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平。将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们对学习记忆过程检测的干扰。既可以检测空间参考记忆又可以检测空间工作记忆。在用固定平台测试小鼠的空间参考记忆后再将平台的位置改为不固定，就可检测它们的工作记忆能力。显然，寻找不固定平台的认知过程要复杂一些，需要动物对时间和空间上的分离信息加以整合和判断。操作简便，数据误差较小。,Morris水迷宫的不足之处,由于需要监视系统及分析软件，只有少数装备较好的实验室可以实施。实验程序的设计需要考虑的因素较多，同时需要实验者具备一定的神经生理学、认知生理学和数理统计方面的知识，给实验的开展和结果的解释带来困难，同时也限制了该迷宫的深入广泛的应用。由于体力消耗太大，体温也丧失过多，年老体弱鼠完成任务较困难。并非所有鼠株都适合于Morris迷宫测试，如BALB/c不能学会该任务（成绩并不随天数的增加而进步），129/SvJ的学习成绩也偏差。个体间的成绩差异巨大。某些株，如129/SvJ株的小鼠由于有年龄相关性视路病变(visualpathology)，在衰老时完成以视觉为基础的学习记忆任务时就会出现困难。在C57BL/6株，由于严重的秃头症（alopecia）存在，可能使某些小鼠产生抑郁，加上溃疡性皮炎，最终可能影响小鼠的游泳能力而影响实验成绩。对轻微的学习记忆能力的减退，该迷宫程序可能不敏感。所占实验场地过大。,LashleyIII水迷宫,.,52,LashleyIII水迷宫,是一种相对复杂的迷宫。它含有动物必须学会避免的盲端（culs-de-sac）和动物必须做出正确的左或右拐弯的T选择。实验进行5天，每天进行2次测试（上下午各1次）。每天的2次测试被平均。指标包括：学习指数（正确进入数/进入总数）、游向目标时的盲端进入数及T选择错误数、向后进入总数、逃生所用时间等。,.,53,八臂放射状旱迷宫,八臂放射状旱迷宫，是Olten和Samnelson在1976年设计的，做为一种评估大鼠空间学习记忆的方法。它可以同时评估实验动物的工作记忆和参考记忆。原理利用食物作为激励措施而到达目的地，饥饿的动物需要实行特别的搜索顺序或利用最短的时间或最小的错误来寻求奖赏。,.,54,八臂放射状旱迷宫,装置八臂放射状旱迷宫是由从中央平台伸出的8个相等的臂呈放射状排列组成，8臂中有4臂的末端放有食物，在同一天的整个实验过程中哪些臂中含有食物保持固定不变，但每天之间均有改变。迷宫周围有若干空间线索。实验前大鼠需被剥夺食物和水，实验开始时，大鼠被放在中央平台处后去寻找食物。在实验中大鼠需记住哪些臂已被探索过，食物已被摄取，以避免再次进入，从而在最短的时间内获得最大量的食物。同时，在每天的实验结束后，大鼠还必须放弃当天的记忆信息，以准备适应第二天的实验。,.,55,八臂放射状旱迷宫,应用评估动物工作记忆和参考记忆工作记忆是指利用一个仅仅在短时间内的保留信息，或称为实验特定信息（trial-specificinformation）而获得的记忆，它是对实验中可变事物的记忆能力。参考记忆是对持续存在的信息，或称为任务特定信息（task-specificinformation）的记忆，它是对实验中不变事物的记忆能力。,.,56,八臂放射状旱迷宫,观察指标时间测定和错误积分存在的问题优点：同时评估实验动物的工作记忆和参考记忆不足：气味的影响。包括食物的气味、其他动物的气味以及动物自身的气味。实验动物被限制食物和水，由此会带来的影响。并且不同的食物奖赏也可产生明显的影响；另外，动物种属的不同使其在食物需求上也可导致不同的结论。,.,57,穿梭箱实验,试验装置实验箱大小为50cm16cm18cm。箱底部格栅为可以通电的不锈钢棒，箱底中央部有一高1.2cm的挡板，将箱底部分隔成左右两列。实验箱顶部有光源，蜂鸣音控制器。训练时，将大白鼠放入箱内任何一侧，20s后开始呈现灯光和（或）蜂鸣音，持续15s，后10s内同时给以电刺激(100V，O.2mA，50Hz，AC)。最初，动物只对电击有反应，即逃至对侧以回避电击。20s后再次出现条件刺激并继之在动物所在侧施以电刺激，迫使动物跳至另一侧如此来往穿梭。当蜂鸣音或灯光信号呈现时，大白鼠立即逃至对侧安全区以躲避电击，即认为出现了条件反应(或称主动回避反应)。每闲天训练一回，每回100次。约训练45回后动物的主动回避反应率可达8090。此法可同时观察被动和主动回避性反应.此外从动物的反应次数也可以了解动物系处于兴奋或抑制状态。,.,58,穿梭箱实验,自动记录系统可以输出以下内容：(1)动物序号；(2)遭受刺激次数；(3)遭受刺激时间；(4)主动回避反应时间。以上各值均为在设定的穿梭次数内反应的总和。遭受电激次数是被动回避的次数，该值与设定循环次数之差即为主动回避次数；刺激时间是指动物在被动回避过程受到电刺激的时间和，该值愈小，说明动物被动反应愈敏捷，主动回避时间是指动物在接受条件刺激的时间长短，该值越短，说明动物主动回避反应越迅速,.,59,跳台试验,跳台实验属一次性刺激回避反应实验（ONETRAILAVOIDANCETEST）。装置：试验装置为一长方形反射箱，大小为10cm10cm60cm，用黑色塑板分割成5间。地面铺以栅栏，间距0.5cm，可以通电，每间角落置一高和直径均为4.5cm的平台。,跳台试验,原理在一个开阔的空间，动物大部分时间都在边缘及角落里活动。在一个方形中心设置一个高的平台，当把动物放在平台时，它几乎立即跳下平台并向四周探索接近边缘指标潜伏期：记录动物从上平台到第一次下平台的时间操作步骤一个典型的例子包含三个过程：熟悉过程学习过程记忆检测熟悉过程：将动物放在平台上，开始计时，至动物跳下。此时间段为潜伏期。动物探索10s以后，放回笼中学习过程：动物一旦从平台上跳下后，立即受到电刺激，然后放回笼中记忆检测：学习试验24h后，将实验动物重新放回平台上，记录跳下平台的潜伏期。动物跳下平台或持续停留在平台上标志着验的结束（终止时间为60s）。将动物放入反应箱内适应环境3min，然后立即通以36V交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至栅栏上，受到电击后又迅速跳回平台。如此训练5min，并记录每鼠受到电击的次数或叫错误次数（numberoferrors），以此作为学习成绩。24h后重做测试，此即叫记忆保持测试。记录受电击死亡动物数、第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误次数。,.,61,二、电生理学,电生理学的方法包括胞外记录、胞内记录、脑内电刺激、电压钳、膜片钳、脑电图等技术。,.,62,Event-RelatedPotential(事件相关电位，ERP),128ChannelCap,BriefchangesinEEGsignalTime-alignedwithstimulusonsetAveragedover100sofresponsesExcellenttemporalresolutionTerriblespatialresolution,ERP定义：狭义：凡是外加一种特定的刺激，作用于感觉系统或脑的某一部位，在给予刺激或撤消刺激时，在脑区所引起的电位变化。广义：凡是外加一种特定的刺激作用于机体，在给予刺激或撤消刺激时，在神经系统任何部位引起的电位变化。,波形命名与极性按极性和出现顺序P1，N1，P2，N2，P3按极性和平均潜伏期N200，P300，N400.正性波（P），负性波（N），一般下正上负波形识别与测量,膜片钳（patchclamp）,内尔(Neher)萨克曼(Sakmann)（1944-）（1942-）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）合作发明了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。二人共获1991年诺贝尔奖。,膜片钳,Thepatchclampconsistsofanelectrodeinsideaglasspipette.Thepipette,whichcontainsasaltsolutionresemblingthefluidnormallyfoundwithinthecell,isloweredtothecellmembranewhereatightsealisformed.Whenalittlesuctionisappliedtothepipette,thepatchofmembranewithinthepipetteruptures,permittingaccesstothewholecell.Theelectrode,whichisconnectedtospecializedcircuitry,canthenbeusedtomeasurethecurrentspassingthroughtheionchannelsofthecell.Furthermore,wecanuseourelectricalcircuitrytoclampthemembranepotentialtoanyvoltagethatwedesire:veryhandywhenmeasuringtheactivityofvoltage-dependentchannels.,.,68,膜片钳,经典记录模式：贴附式（Cell-attached或oncell)内膜向外式(Inside-out)外膜向外式(Outside-out)全细胞记录方式(Whole-cellrecording),.,70,生物化学方法,经典的生物化学方法包括：离心电泳层析质谱等由于生物化学方法与药理学、免疫学等其他学科相结合，又发展了：放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)放射受体免疫印迹等方面,.,71,离心（centrifuge）,离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下