胰蛋白酶的分离纯化PPT课件

胰蛋白酶的分离纯化,1,.,主要内容,胰蛋白酶的结构、理化性质胰蛋白酶功效分离纯化路线,2,.,胰蛋白酶结构及理化性质,胰蛋白酶是从牛、猪、羊的胰脏提取，纯化获得的结晶，再制成的冻干制剂。易溶于水，不溶于三氯甲烷、乙醇、乙醚等有机溶剂。在pH1.8时，短时间煮沸几乎不失活；在碱溶液中加热则变性沉淀，Ca2+有保护和激活作用，胰蛋白酶的等电点为pH10.1。牛胰蛋白酶原有229个氨基酸组成，含6对二硫键，其氨基酸排列顺序和晶体结构已被阐明。在肠激酶活自身催化下，酶原的N末端赖氨酸与异亮氨酸残基之间的肽键被水解，释放出来缬-天-天-天-天-赖6肽，生成有活性的胰蛋白酶。牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量23800。猪胰蛋白酶的化学结构与牛胰蛋白酶十分相似，在氨基酸残基排列顺序中，只有41个氨基酸残基不同，但分子构型有很大区别。沉降系数S20W为2.77SpI=10.8，热稳定性较牛胰蛋白酶稳定，Ca2+对酶的保护作用不及牛羊的明显，无螯合Ca2+的中心部位。有6对二硫键，断裂12个键，均不至于破坏酶分子的完整结构而保护了酶的活性。酶的活力分别相当于牛的72%及羊的61%。羊胰蛋白酶与牛、猪的相似，但其活力略高于牛和猪的。,3,.,胰蛋白酶的功效,为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处理。,4,.,胰蛋白酶分离纯化路线,胰蛋白酶粗提液的获取,1.将胰脏绞碎成胰浆，在510存放24h以上，使胰酶自身活化。2.3500r/min下离心20min，取上清液用二层纱布过滤，然后根据等电点沉淀的原理用稀硫酸将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出来。3.采用透析袋透析，然后用硫酸铵盐析法将胰蛋白酶从粗提液中沉淀出来，使其得到浓缩，并除去部分杂质（透析袋透析原理：由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差的作用下，高分子溶液中的小分子溶质透向透析液一侧，同时透析液中的缓冲液渗入蛋白溶液一侧，经过透析液反复换液后，即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。）,5,.,胰蛋白酶分离纯化路线,胰蛋白酶纯化,采用离子交换层析原理：蛋白质在其等电点以下时带正电荷，可以被阳离子交换树脂所吸附；而蛋白质在等电点以上，带负电荷，可以被阴离子交换树脂所吸附。因为胰蛋白酶等电点为10.1且在酸性条件下稳定，所以功能基团考虑使用阳离子此外，遵循大分子物质分离一般采用弱性，因此使用弱酸性阳离子，骨架材料选择凝胶，因为其孔度大，亲水性好。离子交换剂的离子形式考虑用盐型。,6,.,恒流泵,部分收集器,离子交换柱,离子交换流程简图,离子交换层析法纯化胰蛋白酶