第四章-中药制剂的含量测定

第四章中药制剂的含量测定,第一节定量测定的目的与意义,含量测定是中药制剂质量控制的重要指标测定对象：有效成分、指标成分、毒性成分目的：判定药物的优劣，保证临床用药的安全、有效注意点：与西药含量测定的区别观点：指标成分有效成分单一成分多指标成分/有效成分,第一节定量测定样品的处理,样品处理的作用充分释放被测成分除杂纯化富集浓缩或衍生化使样品形式、溶剂符合测定要求,一.样品的粉碎,样品粉碎的目的：保证所取样品均匀且有代表性较快且完全地提取被测成分,粉碎设备：粉碎机、研钵、食品处理机高速匀浆机或玻璃匀浆器。,二.样品的提取,冷浸法适用：热不稳定的样品方法：称取一定量样品置于带塞容器内，加入适量溶剂（样品量的1050倍），称重，浸泡提取，浸泡时间1224小时。浸泡后再称重，补足溶剂。测定：部分测定法（等量法）全部测定法（总量测定法）优点：操作简单缺点：费时、费溶剂、不易提取完全,回流提取法适用：热稳定性的成分方法：以单一溶剂或混合溶剂于水浴/电热套加热回流提取优点：提取效率比冷浸法高，提取时间短，缺点：提取杂质较多不宜用于热不稳定或挥发性的成分,连续回流提取法（索氏提取）适用：热稳定性的成分方法：样品置索氏提取器中，用遇热可以挥发的溶剂进行反复提取优点：提取效率高，所需溶剂少提取杂质少，操作简便缺点：受热易分解的成分不宜使用,超声提取法适用：热稳定性的成分方法：样品置适当容器中，加入提取溶剂，放入超声振荡器中提取。优点：提取效率高，提取速度快，操作简便注意：超声频率、提取时间、温度需考察,超临界流体提取法（SFE）适用：主要用于热不稳定成分或挥发性成分，也可热稳定性成分主要用于非极性、弱极性化合物，也可极性化合物加入极性改性剂（甲醇、氯仿、苯），增加其溶解能力。方法：超临界流体萃取仪优点：萃取效率高、速度快、准确度高、选择性较高、节省溶剂、易于自动化，可避免使用易燃，有毒的有机溶剂，并能与色谱和光谱等仪器联用。,二.样品的分离净化,沉淀法：利用某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液的精制方法蒸馏法：利用某些被测成分具有挥发性，采用蒸馏法，收集馏出液进行含量测定；或某些成分经蒸馏分解成挥发性成分，利用分解产物（要求结构明确）进行测定。最常用：水蒸气蒸馏法适用：挥发油，小分子生物碱优化：蒸馏液中加入一定量无机盐（盐析作用），使挥发性成分更完全地蒸馏出来,液一液萃取法直接萃取法：利用被测成分与干扰成分在有机溶剂（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取达到分离净化的目的。萃取次数：实验考察（回收率符合）溶剂的选择：根据被测组分疏水性的相对强弱选择极性适当的溶剂水相pH的控制：弱酸性成分pHKa-2弱碱性成分pHPKa+2盐析作用：水相用NaCl饱和，提高提取率。,2.离子对萃取法适用：高度离解的有机酸、有机碱中药制剂分析主要用于生物碱（B）离子对试剂：常为酸性染料（In-）如：溴百里酚蓝（BTB）和溴甲酚绿（BCG）注意：水相pH值的控制离子对试剂的选择。,色谱法最常用：经典微柱色谱（固相萃取、液固萃取）方法：将样品溶液加到装有合适固定相的色谱柱中，将被测成分保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定。或者：使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。适用于：总类成分的含量测定进展：商品LSE柱作为GC、HPLC的预处理柱,LSE常用填料：硅胶、氧化铝等：传统吸附剂不极性吸附作用氧化铝：用于生物碱、苷类等碱性、中性成分的测定，吸附酸性成分硅胶：适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。键合相硅胶：十八烷基键合相硅胶（C18，ODS）、C8分离脂溶性杂质或成分苯基、氰基键合相硅胶分离水溶性杂质或成分,大孔树脂：分为极性和非极性型，D101最常用注意：预处理；定量时回收率聚酰胺：氢键吸附常用于含phOH的黄酮类成分硅藻土、纤维素：亲水型填料，分配作用流动相：与水不混溶的有机溶剂洗脱：亲脂性的成分离子交换树脂：萃取样品液中可离解化合物除去样品中的离子，防止组分分解,消化法目的：重金属检查限量较低，有机成分往往会严重干扰测定，须采用合适的方法破坏这些有机物常用的破坏方法：湿法消化，干法消化,湿法消化硝酸高氯酸法适用于血，尿、组织等生物样品和动植物药制剂的破坏有机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一般呈高价态。本法不能用于含氮杂环药物的破坏,硝酸硫酸法适用于大多数有机物质的破坏破坏得到的无机金属离子均为高价态不能用于含碱土金属有机药物的破坏（不适用于与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子）,硫酸硫酸盐法常用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态（三价砷或锑）。样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫酸盐提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。,其它湿法硝酸硫酸高氯酸法硫酸氧化剂法（过氧化氢法、高锰酸钾）破坏后，金属呈高价态,注意点：所用仪器一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏瓶所用试剂应为优级纯水应为去离子水或高纯水按相同条件进行空白试验校正操作在通风橱内进行,干法消化将有机物灼烧灰化达到分解目的方法：将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水Na2CO3或轻质MgO以助灰化。混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。,适用：湿法不易破坏完全的有机物；某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。不适用：含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏,注意事项：（1）加热或灼烧时，应控制温度在420以下，防止金属化合物的挥发（2）一定要灰化完全（3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但不要轻易弃去,第二节常用定量分析方法,药物含量测定是评价药品质量优劣的重要手段,常用测定方法：（Ch.P2000收载较多）化学分析法光谱法（UV、FD）色譜法（HPLC、GC、TLCS）,一.化学分析法,包括重量分析和滴定分析适用：主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含矿物药制剂中的无机成分如：总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药特点：仪器简单，结果准确但有一定的局限性，灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，不适宜微量成分测定,（一）重量分析法,挥发法：测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。如：干燥失重、水分灰分及炽灼残渣的测定,萃取法：根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。适用：总皂苷、总有机酸、总生物碱如：冰硼散中冰片的含量测定地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定、昆明山海棠片中总生物碱的含量测定甘草浸膏中甘草酸的含量测定,沉淀法：将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量。适用于：制剂中纯度较高的成分。如：西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定苦参片中苦参总碱的含量测定复方元胡注射液总碱的测定,（二）滴定分析法,1.容量分析法的适用性及特点适用：常量组分的分析,特点：操作简便、快速，结果准确，一般相对误差5），分别测定吸光度，绘制A-C曲线或求出回归直线方程（r0.999）。在相同条件下测定供试品溶液的吸光度，求得供试品中被测成分的浓度或含量。,（二）计算分光光度法,适用：多组分的含量测定原理：吸光度具有加和性方法：双波长法（等吸收点法和系数倍率法）三波长法导数光谱法,（三）差示光谱法,基本原理1.能提供一个合适的参比溶液2.在两种不同的介质环境或实验条件下，被测组分有不同的特征光谱（即不同的化学结构），而赋形剂或其它共存组分的光谱不变。因而可消除它们的干扰。,三.薄层扫描法,薄层吸收扫描法适用于:在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分分:反射法和透射法，薄层扫描中大多采用反射法,定量依据,Kubelka-Munk理论及曲线以斑点的相对反射率或相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度，说明固定相的散射参数SX对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响，获得不同散射参数SX时斑点的A-KX理论曲线，即Kubelka-Munk曲线。不符合LB定律：薄层板存在明显的散射现象,Kubelka-Munk曲线说明了薄层色谱斑点的吸光度与其浓度间呈非线性关系，解释了薄层扫描法中标准曲线的弯曲问题，,2.薄层荧光扫描法,适用于：本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定特点：专属性强，灵敏度比吸收法高13个数量级，但适用范围较窄。定量原理：当溶液浓度很稀时（abc0.05）F=KC,高效液相色谱法,高效液相色谱法是在经典的液相柱色谱法的基础上引入了气相色谱的理论和技术，采用高压泵，高效固定相以及高灵敏度在线检测器发展而成的分离分析方法。,分析方法,正相分配色谱法常用于分离强极性化合物。常用极性键合相为氨基键合相（强极性）、氰基键合相（中强极性），流动相常选用低极性溶剂如烃类，加入适量极性溶剂如醇类等调节洗脱液。梯度洗脱时，通常逐渐增大洗脱剂中极性溶剂的比例，故样品中极性小的组分先流出，极性大的组分后流出。,氰基键合相的分离选择性与硅胶相似，但极性比硅胶弱。许多能在硅胶上分离的样品，可以在氰基键合相上完成。氰基键合相对双键异构体有很好的分离选择性。氨基键合相是分析糖类最常用的固定相，常用乙腈-水为流动相。,反相分配色谱法,适合于分离弱极性和中等极性的化合物。极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。常用的固定相为十八烷基硅胶键合相C18(ODS)，其次是辛基硅烷键合硅胶；流动相采用甲醇水或乙腈水。有时也可加入适当的酸或碱来控制流动相的pH值，以防止出现不对称色谱峰。反相色谱常采用梯度洗脱，使每个组分都在适宜条件下获得分离,离子对色谱（IPC）,在流动相中加入溶质分子电荷相反的离子对试剂，来分离离子型或可离子化的化合物的方法。离子对色谱法分为正相离子对色谱和反相离子对色谱法，最常用的是反相离子对色谱。它使用反相色谱中常用的固定相（ODS），能同时分离离子型化合物和中性化合物。,HPLC条件的选择,固定相选择一般的液相色谱适合的相对分子质量范围200-2000，相对分子质量大于2000的则用空间排阻色谱较佳。样品为酸、碱化合物，则采用离子交换色谱；异构体采用液-固吸附色谱；样品为脂肪族或芳香族，可采用液-液分配色谱或液-固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的样品可用液-液分配色谱。,正相色谱主要用于分离极性化合物，常用氢基、氰基键合固定相。反相色谱应用最为广泛，适于分析非极性和中等极性的化合物最常用的固定相是十八烷基键合固定相，,流动相选择,根据不同类型的色谱法选择流动相正相分配色谱流动相是以烃类（如己烷、烷等）为主，加入少量极性溶剂（如氯仿、甲醇等）改变流动相的极性和组成，分离异构体、极性化合物等。反相分配色谱流动相是以水为主，再加入能与水混溶的有机溶剂，通过改变有机溶剂的组成，调整组分的容量因子，改善分离效率，甲醇是最常用的有机溶剂，其次是乙腈和四氢呋喃。,在反相键合相色谱中，用水-甲醇、水-乙腈溶液为流动相，可分离极性物质。用水和无机盐的缓冲溶液作流动相，可以分离易离解的物质，如有机酸、有机碱、酚类等。,离子交换色谱流动相通常是盐类的缓冲溶液。通过改变流动相的PH、缓冲溶液的类型、离子强度、以及加入有机溶剂、配合剂都会改变分离选择性，提高分离效果。,空间排阻色谱流动相的选择不是为了提高色谱柱的选择性，而是为了使样品更好地溶解，或是为了减少流动相黏度，提高柱效。选用低黏度的流动相，其沸点要比柱温高25-50，且应与选用的固定相和检测器相配。,洗脱技术,根据分离度的要求，在色谱分离过程中样品组分的k值范围应控制在1-10之间。如果样品组分较少、性质差别不大，一般采用等度洗脱（溶剂组成在一分析周期里保持恒定）可以使所有组分的k值都处于这个范围内。对于组分数目较多、性质相差较大的复杂混合物，为使各组分均得到满意的分离，必须采用梯度洗脱技术，即在一个分析周期中，程序控制流动相的组成（如溶剂的极性、离子强度、PH值等）改变，使每个组分都在适宜的条件下获得分离。,梯度洗脱可以采用二元混合溶剂或多元混合溶剂，即所谓二元梯度和多元梯度。梯度洗脱程序一般是以等强度洗脱的结果为基础，通过实验加以确定的。对极性固定相，梯度溶剂范围从正己烷到氯代烷；对非极性固定相，一般采用水-乙腈、水-甲醇线性梯度。梯度洗脱特别适用于极性范围很宽的混合物分离。优点缩短总分析时间，提高分离度，是使k值相差103104的样品组分，在合理分析速度下得到适当分离度的唯一方法。改善峰形，提高峰的对称性，减少峰的区域宽度，使微量组分易被检出，降低最小检出量，提高检测灵敏度。,检测器的选择,针对样品的性质不同选择适合的检测器。紫外检测器高灵敏度，但只能用于有可见紫外吸收的化合物。主要用于芳烃与稠环芳烃、芳香基取代物、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羧基与羰基化合物等。蒸发光散射检测器用于挥发性低于流动相，紫外无吸收或呈末端吸收的样品组分，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低。主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸及甾体类等几十类化合物。,荧光检测器适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。电化学发光检测器对于电活性物质来说是一类较好的选择性检测器。主要用于有机胺类化合物。,前处理,流动相脱气：流动相在使用前必须进行脱气处理，目的是除去其中溶解的气体。常用的脱气方法有：超声波振动脱气、抽真空脱气、加热回流脱气、吹氦脱气、真空在线脱气。超声波振动脱气，将欲脱气的流动相置放于超声波提取器中，用超声波振荡10-15min，此法的脱气简单，最常用。过膜：流动相及供试液须经过0.45um或0.2um滤膜过滤,VanDeemter方程式在HPLC中的表达式为：H=A+CUHPLC可以近似地认为流动相的流速与板高成直线关系，流速增大，板高增加，色谱柱柱效降低。为了兼顾柱效与分析速度，一般都尽可能地采用较低流速。内径4.6mm柱，流量多采用1mL/min。,色谱适用性试验,色谱适用性试验可以用来评价高效液相色谱法色谱条件。按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。,1.色谱柱的理论板数（n）在选定的状态下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计）和半峰高宽（Wh/2），按n5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数。如果测得的理论板数低于此样品规定的最小理论塔板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论塔板数达到要求。,2.分离度定量分析时，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为：R2（tR2tR1）/W1+W2tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1、W2为此相邻两峰的峰宽。分离度应大于1.5。,3.重复性样品的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0。也可按照各样品校正因子测定项下，配置80、100、120的对照溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0。,4.拖尾因子为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子（T）是否符合规定，或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：TW0.05h/2d1W0.05h为0.05峰高处的峰宽d1为峰极大至峰前沿之间的距离。除另有规定外，T应在0.951.05之间。,定量分析方法,液相色谱法的定量方法，常用外标法及内标法，也可用内加法、校正因子法定量。1.外标法以试样的对照品作标准物质，与标准物质对比求算试样含量的方法。外标法可分为外标工作曲线法、外标一点法及外标二点法等，前二种方法常用。优点是不需要知道校正因子，只要被测组分出峰、无干扰、保留时间适宜，即可进行定量分析。缺点，进样量必须准确，否则定量误差大。在HPLC中，一般用六通阀定量环进样，进样量误差相对较小，因此外标法是HPLC常用的定量分析方法之一。,外标工作曲线法（简称工作曲线法）,用试样的对照品，配制一系列浓度不同的对照品溶液，准确进样，测量峰面积或峰高，以对照品溶液的浓度或进样量为横坐标，以峰面积或峰高为纵坐标绘制工作曲线，计算回归方程及相关系数。相同条件下，注入供试品溶液，利用此曲线或回归方程A=a+bC(计算样品溶液的浓度）。,（2）外标一点法,只有在工作曲线通过原点，即截距为零时，才可用外标一点法进行定量分析，否则需用外标二点法定量。用一种浓度的对照品溶液对比，求算同一物质的样品（色谱组分）含量的方法，称为外标一点法。,Ci与Ai分别为样品中待测组分浓度和峰面积；Cs与As分别为对照品溶液浓度与峰面积。,峰形为正常峰时，常用随行外标一点法即每次测定都同时进对照品与样品，并且浓度接近，以减少因仪器不稳定带来的误差。,2.内标法,将一定量的内标物加入到样品中，再经色谱分析，根据样品的重量和内标物重量以及待测组分峰面积和内标物的峰面积，就可求出待测组分的含量。内标法可分为工作曲线法、内标一点法（内标对比法）、内标二点法及校正因子法。所用的内标物的要求同气相色谱。,内标法优点：可抵消仪器稳定性差，进样量不够准确等原因带来的定量分析误差。缺点：样品配置比较麻烦，不易寻找内标物。,（1）工作曲线法,内标工作曲线法与外标法相同，只在各种浓度的标准溶液中，加入相同量的内标物，进样。分别测量组分i与内标物s的峰面积A（或峰高），以其峰面积比Ai/AS浓度为纵坐标，以对照品溶液的Ci（标准）绘制工作曲线，计算回归方程式Ci=bAi/As+a及相关系数。b：斜率；a：截距Ai：待测组分的峰面积或峰高；AS：内标物的峰面积或峰高。,（2）内标对比法（内标一点法）,内标对比法不需知道校正因子又具有内标法的定量准确度与进样量无关的特点。方法简便实用。在药物分析中分析结果（含量）常用标示量%表示,mi为药物对照品的量，m是取样量,W为平均片重（或丸重等）,3.内标法加校正因子法,用此法需要已知校正因子，而高效液相色谱法的校正因子很难由手册中查到，常常需要测定。测定校正因子需配制含有内标物的标准溶液，在相同实验条件条件下进样510次，分别测定峰面积，计算各组分的相对重量校正因子。,mi与ms分别为待测物与内标物的量；Ai与As分别为它们的峰面积。自测的相对重量校正因子，只能在此实验条件下使用，而无通用性，引用时需注意。,内标法的计算公式：,Cs为内标物的浓度，f为较正因子Ai、As分别为待测组分和内标物的峰面积。,气相色譜法,特点：高灵敏度、高选择性、高柱效、快速、用量少适用：具有挥发性且热稳定性好的物质一般色譜图于30分钟内记录完毕,色谱条件的选择,主要依据:分离度方程速率理论,色谱柱的选择：固定相、柱长柱温的选择：载气的选择：峰扩张、柱压降对检测器的灵敏度进样量的选择：尽量少气化温度的选择：样品的挥发性、沸点及进样量检测室温度,系统适用性试验同HPLC法,定量方法由于GC一般手动进样，且进样量小（0.1-1l），故GC大多采用内标法定量,1.归一化法,1）前提：样品中所有组分都能流出柱且对检测器都有响应。2）计算公式:miAifipi=100%=100%mA1f1+A2f2+Anfn,如果组分为同系物fi近似相同，则可简化为AiPi=100%A1+A2+An,优点：a.简便，结果与进样量无关,操作条件影响不大。b.比其它方法易行。宜于进样量少不易测准的液体样品。c.当分析同系物时可不求f而直接把面积归一化。,缺点：a.含高沸点或不出峰的组分b.检测器上无信号的组分c.无法求得f的组分（未定性或峰重叠）,2、内标法,前提：有适合的内标物对内标物的要求：a.样品中不含此成分b.能单独出峰且能与组分完全分开c.峰位置尽量靠近组分d.加入的重量接近于组分的量,公式fimi/Aififsms/AsmiAi=fimsAsmimimsAimspi=100%=100%=fi100%mmsmAsm一般来说，TCD标准物用苯，FID用正庚烷。,操作过程a.先配制已知浓度的标准样品，加一定量的内标标准液标准色谱图b.未知浓度的样品加同量内标待测溶液样品色谱图,(Ci%)样品(Aifi/Asfs)样(Ai/As)样(Ci%)标准(Aifi/Asfs)标(Ai/As)标(Ai/As)样(Ci%)样品(Ci%)标准(Ai/As)标,优点：a.定量准确b.操作条件影响不大c.没有归一化的缺点缺点：每次测定都要精确配制含内标的样品，另内标的选择也较难。,3、外标法即以待测组分的标准品作对照物,与对照物对比求算待测组分含量的方法.优点：操作简便、计算方便缺点：需严格控制进样体积，操作条件应稳定,单点校正前提：曲线过原点配一与被测组分含量接近的标样Ps，进样量同分析样品。AiPiPs=KiAiAsKi：标样单位峰面积所代表的百分含量不过原点，双点校正。,荧光分析法,特点：灵敏度高，选择性好。（荧光法灵敏度可达1010g/ml1012g/ml，而一般紫外可见分光光度法的灵敏度约为107g/ml。）适用：成分本身具有荧光或经衍生化能转变为荧光化合物稀溶液中测定产生荧光必须具备两个条件：第一是物质分子必须有强的紫外可见吸收；第二是必须具备较高的荧光效率。,原理：若浓度C很小，当ECL0.05时，则：F=2.3KfI0ECL=KC在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系，此系荧光法定量分析的依据。,定量分析方法：,1标准曲线法荧光分析一般采用标准曲线法（校正曲线法），在绘制标准曲线时，常采用标准溶液系列中某一溶液作为基准，先将空白溶液的荧光强度调至0，再将该标准溶液的荧光强度调至100或50，然后测定系列中其它各个标准溶液的荧光强度F，再绘制标准曲线，即F-C曲线。,在实际工作中，当仪器调零之后，先测定空白溶液的荧光强度F0，然后测定各个标准溶液的荧光强度F，得（FF0）就是标准溶液本身的荧光强度。通过这样测定，再绘制标准曲线，即（FF0）-C曲线。为了使不同时间绘制的标准曲线能前后一致，每次绘制标准曲线时均采用同一标准溶液进行校正。,如果试样溶液在紫外光照射下不很稳定，则须改用另一种性质稳定，而且所发生的荧光和试样溶液的荧光相近似的标准溶液作为基准。如测定维生素B1时，采用硫酸奎宁的0.05mol/LH2SO4溶液作为基准(适用于蓝色荧光)；若为黄绿色荧光可用荧光素钠的水溶液；红色荧光可用罗丹明B水溶液为基准。,2比例法,若标准曲线通过零点，可用比例法进行测定。配制一标准溶液，使其浓度在线性范围内，测定荧光强度FS，然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度FX。由标准溶液的浓度CS和两种溶液的荧光强度比，求得试样中荧光物质的浓度CX或含量。在空白溶液的荧光强度不为零时，按下式计算。,3解线性方程法多组分混合物的荧光分析也可以象吸收分光光度法一样利用荧光强度的加和性质，采用解线性方程组的方法、双波长及多波长等方法从混合物中不经分离即可测得被测组分的含量。,第四节含量测定方法的效能指标,常用的效能评价指标有：准确度、精密度、选择性、检测限、定量限、线性与范围、耐用性等。,分析方法的效能指标可以作为对分析方法的评估尺度，也可作为建立新的分析方法的实验研究依据。,一.准确度,考察准确度常用加样回收率评价中药制剂含量测定的回收率一般要求在95%105%(n5)，RSD一般应在3%以内复杂操作样品，可要求略低，90%110%生物样品，一般控制回收率在85%115%（样品药浓200g/L）80%120%（样品药浓99.5)或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于0.2；进行回收率试验。回收率一般在99.7100.3之间。,2.UV法：用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于1。制剂的测定，回收率一般应在98102之间。,线性：吸光度A一般在0.20.7，浓度点n5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，r应大于0.999(n5)，方程的截距应近于零。,3.HPLC法：要求RSD2，回收率98102之间。线性范围：用精制品配制一系列标准溶液，浓度点n应为57，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，r应大于0.999，截距应趋于零。,专属性：要考查辅料、有关物质或降解产物对主药的色谱峰是否有干扰，如有干扰应设法排除,99：73.精密度是指（B）