分子诊断技术平台的进展及展望PPT课件

分子诊断技术平台的进展及展望,内容病原体检测技术概述病原体核酸检测技术概述病原体核酸检测新技术应用核酸检测新技术存在问题及发展,.,3,背景,治疗,近10年新发传染病绝大多数是病毒引起,.,4,病毒与亚病毒6819种408属,动物病毒1917种204属,感染人296种37属,背景,.,5,背景,检测技术概述形态学（电镜）组织学（细胞培养）免疫学（ELISA,WesternBlot,IF,NT,HI）分子生物学（PCR,RT-PCR,qPCR,mPCR,Microarray,Sequencing）,传统检测方法的局限性胶体金（灵敏度窗口期）ELISA（灵敏度窗口期）PCR/RT-PCR（通量未知病原）Real-timePCR（通量未知病原)巣式PCR/RT-PCR(污染，电泳）,.,9,核酸扩增检测技术概述,核酸扩增技术是一种常规生物技术，是分子生物学的基础研究方法。作为主流检测技术被广泛应用于实验室、医院。核酸扩增技术可分为变温扩增技术和等温扩增技术。,变温扩增,PCRRealtimePCRRTPCRNestedPCRMultiplexPCRDigitalPCR,等温扩增,TMA/NASBASMARTHDASDA/NDARCA/MDALAMP/IMSARPA,基于T7Promoter基于解旋酶基于链置换活性的DNA聚合酶链置换和重组酶,.,10,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPAMultiplexPCRNestedPCR(一步法）DigitalPCR自动化检测再测序芯片PCR阵列二代测序（NGS）POCT（现场检测）,核酸检测技术发展趋势未知病原多病原高通量自动化现场技术(POCT),中心实验室科研方向简介,未知病原检测技术平台,高通量自动化工作站技术平台,多病原、症候群检测技术平台,现场检测技术平台,4,1,2,3,现场检测技术-LAMP,IMSA多病原检/监测技术-GeXP,Qiaxcel,RPM未知病原鉴定-NGS，VIDISCA,RPM自动化检测-Liquidhandlingsystem生物信息学支持-VIP软件,检测/监测/鉴定技术平台,病毒检测/监测/签定技术平台及生物信息学,.,15,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPAMultiplexPCRNestedPCR(一步法）DigitalPCR自动化检测再测序芯片PCR阵列二代测序（NGS）POCT（现场检测）,.,16,LAMP技术特点特异性强:2对引物配对6个区域或3对引物配对8个区域灵敏度高：10-100copies设备要求低:不需要PCR仪器，65水浴（等温）检测快速：1小时操作简单：一步法（单管）结果判定方便：颜色（肉眼观察颜色变化和沉淀）吸光值（半定量，650nm比色）普通琼脂糖电泳浊度（浊度仪，实时监测，半定量）,实时荧光定量PCR仪,2小时,水浴、热块、PCR仪、浊度仪,电泳、浊度、颜色指示剂、肉眼观察,1小时,25￥/Reaction,仪器要求,实验结果,反应时间,实验成本,RealtimePCR与LAMP特点比较,RealtimePCR,LAMP,VS,实时荧光定量PCR仪,50￥/Reaction,IMSA/EV71/CA16,JCM,2014,52（6):1862MERS(submitted),Gene,2014,541,123-128,Foodandenviromentalvirology,2014,GEAR/HRV,submitted,内容：LAMP检测技术应用于手足口病例的现场评价合作单位：湖南、山东、河北省CDC标本数量：手足口500份（每省）,LAMP技术的现场评价,LAMP技术现场评价,LAMP检测技术应用于手足口病例的评价(湖南)-AdvancesinInfect.Dis.2012,4(2)110-118,肠道病毒EV71型核酸检测结果比较,肠道病毒CoxA16型核酸检测结果比较,小结临床标本515份EV71符合率100%CA16符合率99.6%参照：国产RealTimePCR检测试剂盒,.,23,IMSA(IsothermalMultipleSelf-matching-initiatedAmplification),目的：建立具有自主知识产权的等温多自配体引发扩增反应专利进入实质审查引物设计软件：www.imsa-,.,24,IMSA与LAMP的特点比较,.,25,IMSA与LAMP方法检测手足口病结果,IMSA方法在常见传染病检测中的应用,IMSA法针对EV71和CVA16检测的最低检测线：利用概率元分析法（probitanalysis）,937,1039,1749,3266,67,108,149,430,.,26,JCM,2014,52（6):1862,IMSA与LAMP方法检测手足口病临床标本结果,IMSA法针对261份手足口临床标本的检测：以商业化qRT-PCR试剂盒检测结果为标准,IMSA法对手足口临床标本的检测，其诊断灵敏度要高于LAMP法,.,27,IMSA检测H7N9方法的建立及评估,5份临床标本的实验室检测验证与国家流感中心结果（qPCR）相一致卫生部临检中心的H7N9检测技术考核Panel共计10份标本，结果全部符合，无漏检及误检2013年12月末，参与广东省新发H7N9病例检测结果符合，显色法结果判读准确H7N9检测试剂盒转让北京爱普益生物科技有限公司,.,28,现场无仪器化提取核酸，发展直接法多重检测（含内参）污染问题,存在问题,.,29,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPAMultiplexPCRNestedPCR(一步法）DigitalPCR自动化检测再测序芯片PCR阵列二代测序（NGS）POCT（现场检测）,多重PCR检测技术温度变化多重PCR(TSP)基于DPO引物溶解曲线多色探针熔解曲线,BioPlex,-J.Clin.Microbiol2012,50(2):288,手足口病相关病毒,J.Clin.Microbiol.2012,50(7)：2384；BRI，2014，648520,腹泻相关病毒,TemperatureSwitchPCR(TSP),GeXP,QIAxcel,BMCMicrobiology.2013,13:58,2013,8(4):e62126,BRI,2013,327620,研究结果,引物浓度调整：嵌合引物和通用引物的比例；各嵌合引物浓度；扩增体系选择三个退火温度调整，三个循环数调整，,研究结果：基于QIAxcel全自动电泳仪,两组中均加入Rnasep-DNA引物作为内参；,基于Qiaxcel的多重PCR检测技术,商业化,发热呼吸道症候群多种病原核酸检测培训班-北京2012.05,“常见16种呼吸道病毒检测的多重PCR试剂盒”应用于十二五传染病重大专项发热伴呼吸道症候群监测项目,“常见16种呼吸道病毒检测的多重PCR试剂盒”应用于全国流感监测网络部分实验室,呼吸道病毒多重PCR快速检测试剂盒,存在问题：病毒变异（引物优化）病毒地区差异（引物优化）结果判断阳性对照（16质粒/RNA）增加病原体（流感亚型）内参更换（假病毒）两管并一管（11种病毒）流感耐药,.,38,基于熔解曲线分析的多重PCR检测技术,.,39,六种常见食源性细菌的检测,引物设计单引物单模板,多引物多模板及引物分组,3沙门氏菌,3副溶血弧菌,1志贺氏菌,2致泻性大肠杆菌,1金黄色葡萄球菌,2李斯特氏菌,1,2,2,3,3,1,十二种腹泻病原体的检测(submitted),.,43,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPAMultiplexPCRNestedPCR(一步法）DigitalPCR自动化检测再测序芯片PCR阵列二代测序（NGS）POCT（现场检测）,.,44,one-stepReal-TimenestedRT-PCR(ORTNRT-PCR)(submitted),基于TSP设计的新型一步法巣式PCR方法,.,45,实验设计：一管四引物两退火温度,不同长度的内外引物退火温度不同引物浓度不同溶解曲线分析极高灵敏度,.,46,实验结果：熔解曲线275:2111-2115,随着越来越多的病毒被发现了，其中可能致病的病毒种类也随之增加。,.,67,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,临床样本,细菌,真菌,寄生虫,其他,病毒,临床宏基因组(ClinicalMetagenomics),高通量测序,可以在不需要目标病原体的背景资料的情况下，一次高通量测序试验就可以完成检测工作。,.,68,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,临床样本,病毒检测如大海捞针,OxfordNanoporesdisruptiveMinIONUSBdevice(GridION),.,70,优化NGS应用于未知病原体筛查流程,NGS测序,病原体分离培养及鉴定,.,71,工作流程及时间点,*从收样至病毒鉴定初步结论，共计用时60小时。,十二五重大专项能力考核,.,72,筛查到的主要病毒基因组覆盖率,.,73,登革病毒I型基因组覆盖率,.,74,MERS-NGS应急工作,.,75,NGSTimeline,.,76,NGSDataAnalysisbyVIPPipeline,.,77,MERS-CoVGenomeAssembly,.,78,建立针对未知病毒鉴定的生物信息学分析方案VirusIdentificationPipeline(VIP),.,79,AdvantagesofVIP（优势）,Cross-platformsupport（交叉平台适用）(454,PGM,Illumina.etc)Ultrafastandaccuracy（超快准确）Lowhardwarerequirements（硬件要求低）One-Touchcommand（一键式命令）,.,80,下一步工作目标：挖掘NGS的潜力vs节约实验成本,.,81,硬件成本和人员要求高（不同需求）标准化（加强内部合作）结合临床数据（精准医学）,存在问题,.,82,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPAMultiplexPCRNestedPCR(一步法）DigitalPCR自动化检测再测序芯片PCR阵列二代测序（NGS）POCT（现场检测）,.,83,现场检测系统（POCT）,免疫