果胶酶的固定化及其活力测定

正文果胶酶的固定化及其活力测定一、目的：果胶酶（EC.3.2.1.15）广泛存在于植物界，参与果实的成熟及其它代谢过程。在果品加工业中，果胶酶主要用于果汁的澄清和提高榨汁率。果胶酶的固定化将有助于提高酶的利用率，同时还可减少外源物质对果制品的污染。果胶酶需求量大，且多为一次性使用，既造成了很大的浪费，又大大提高了产品生产成本。固定化果胶酶可以重复多次使用，能够减少果胶酶的使用量，节约生产成本。通过本实验，了解载体的制备方法，掌握酶的固定化原理及方法。二、原理：本实验固定化方法为共价结合法。以壳聚糖为载体，通过戊二醛共价交联固定化果胶酶。壳聚糖是从蟹、虾外壳中提取的一种氨基多糖（-氨基-1.4-葡萄糖多聚物），对人和动物无毒副作用，是一种具有网状结构，机械性能好，化学性质稳定，耐热性好的酶固定化载体材料，特别是壳聚糖分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂（如戊二醛）很容易与酶发生间接共价结合，使酶牢固地固定在壳聚糖分子上。果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,可用DNS法定量：3,5-二硝基水杨酸与醛糖共热能产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540nm下测其吸光度，从而可计算出果胶酶活力。三、试剂及仪器仪器：冷冻离心机 分光光光度计 比色皿（8只） 摇床 水浴箱 混合振荡器 天平 瓷盘 药匙 剪刀(1把) 记号笔（1支） 通风橱 吸水纸具塞刻度试管（4支） 三角瓶（2支） 烧杯（100ml3个） 试管架（1个）试管（6支） 量筒（100ml1个） 滴管（16个） 离心管(5ml2个,50ml1个)移液管架(1个) 移液管(2ml3个,5ml1个) 注射器（1支） 滴管(1个)吸耳球（1个） 洗瓶（1个） 玻棒（1个） 烧杯(300 ml5个)试剂：乙酸乙酸钠缓冲液（0.2mol/L,pH5.0）磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.0) 3,5二硝基水杨酸氢氧化钠 冰醋酸 丙三醇 戊二醛 无水乙醇 浓盐酸 果胶酶 果胶 半乳糖醛酸 壳聚糖 蒸馏水若干桶四、方法步骤1 载体的制备1.1取壳聚糖4g加入180ml的3%的乙酸中，加20ml甘油搅拌溶解，制得壳聚糖溶液。1.2每组配制60ml 10%的NaOH溶液,均分到三个小烧杯中。用注射器吸取约3ml壳聚糖的溶液滴入10%的NaOH溶液中，即得到壳聚糖的微珠。每组共做三份相同量的微珠，静置10min，蒸馏水浸洗至中性，最后三份微珠各用20ml pH7.0的磷酸缓冲液浸洗一次（3min）。1.3倾去磷酸缓冲液，进行下面步骤。2 载体的活化三份载体中各加入4%的戊二醛溶液约20ml，过夜或者室温活化5h，中间摇动。3 偶联3.1取果胶酶0.1g，加入18ml水、2ml乙酸乙酸钠缓冲液，摇床上振荡提取5h，8000rpm离心10min，上清液即初始酶液，留2ml酶液置于一支干净的5ml离心管中4备用，其余18ml酶液进行下面实验。3.2水洗除去游离戊二醛（5min5次）。3.3将活化的三份载体合并，用所剩酶液覆盖载体，4过夜，中间摇动几次。4 活性的检测4.1水洗除去游离酶（2min4次），回收在小三角瓶中的滤液即残余酶液置于4备用。收集小球，滤纸吸干，称重。另取两份各20粒微珠，各自称重，4保存备用。4.2取两支试管编号按下表所述步骤加样，进行固定化酶的酶活测定(20粒固定化酶颗粒称重)：操作步骤对照管反应管10.4果胶4ml50水浴中预热5min0.4果胶4ml50水浴中预热5min 23ml pH5.0乙酸乙酸钠缓冲液3ml pH5.0乙酸乙酸钠缓冲液350准确反应2h加入完整的固定化酶颗粒20粒50准确反应2h4立即置于沸水浴中，快速加入完整的固定化酶颗粒20粒5沸水浴中煮沸5min立即置于沸水浴中煮沸5min4.3游离酶的酶活测定取两支试管编号甲乙管按下表加样：操作步骤甲管乙管10.4果胶4ml50水浴中预热5min0.4果胶4ml50水浴中预热5min 22ml pH5.0乙酸乙酸钠缓冲液2ml pH5.0乙酸乙酸钠缓冲液3加入初始酶液2ml50准确反应2h加入残余酶液2ml50准确反应2h4立即置于沸水浴中煮沸5min立即置于沸水浴中煮沸5min4.4定性实验：取两支试管分别加入对照管和反应管上清液各1ml，再分别各加入2ml无水乙醇(含1的浓盐酸)，静置15min，观察两管有什么现象出现？为什么？4.5酶活力测定步骤：4.5.1标准曲线制作精确称取0.1000g半乳糖醛酸,用缓冲液定容至100mL,获得1mg/mL的半乳糖醛酸溶液。取6支25mL的刻度试管编号,并按表1加入各种试剂。表1 标准样配制试剂mL试管号1 2 3 4 5 6糖标准液(mgmL-1)00.20.61.01.21.6蒸馏水3,5-二硝基水杨酸5.05.05.05.05.05.0半乳糖醛酸含量mg00.20.61.01.21.6加入试剂后在混合振荡器上振荡均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用流水冷却，加蒸馏水定容至25mL(以1号试管作为空白调零)，在540nm波长下比色测定吸光度。以吸光度为纵坐标，半乳糖醛酸含量为横坐标,绘制标准曲线。4.5.2另取两支试管分别加入对照管和反应管上清液各2ml，再分别加入3，5二硝基水杨酸5ml，沸水浴保温5min,取出立即冷却。观察两管溶液颜色发生了什么变化？为什么？加蒸馏水定容到25mL。以标准空白为基准调零，在540nm处测吸光度(吸光度要在0.0250.4之间,否则重新稀释)。4.5.3另取两支试管分别加入甲管和乙管上清液各2ml，再分别加入3，5二硝基水杨酸5ml，沸水浴保温5min,取出立即冷却。观察两管溶液颜色发生了什么变化？为什么？加蒸馏水定容到25mL。以标准空白为基准调零，在540nm处测吸光度(吸光度要在0.0250.4之间,否则重新稀释)。五、结果分析1.酶活力单位：酶在50、pH5.0的条件下,1h分解果胶产生1mg游离半乳糖醛酸为1个果胶酶活力单位。同理将缓冲液体积固定为3mL，将固定化果胶酶体积忽略，进行固定化果胶酶的活力测定。2.酶活力计算：根据标准曲线