饲料中有毒有害物质的测定解读

2/2/2018 8:53 AM,1,饲料中有毒有害物质的测定,黎观红江西农业大学动物科技学院,2/2/2018 8:53 AM,2,9 饲料中有毒有害物质的测定P244,（一）饲料质量营养质量：饲料营养成分含量；技术质量：饲料的物理特性、如颗粒大小、形状、硬度、适口性等、混合均匀度；卫生（安全）质量：对动物、人和环境的安全；情绪质量：伦理标准或感觉可影响对质量的讨论， 如有争议的动物性原料 或人造着色剂和调味剂。,一、概述,公众对饲料质量重要性的认识的变化 表1,2/2/2018 8:53 AM,3,9 饲料中有毒有害物质的测定,（二）几起典型的饲料安全事故世纪年代中期至年代中期疯牛病（“牛海绵状脑病” ）的暴发流行。1999年1月15日以来，比利时、荷兰、法国、德国相继发生因动物饲料被二恶英污染，导致畜禽类产品及乳制品含高浓度二恶英事件。 “瘦肉精”中毒问题、“毒奶粉（2008）”、“红心鸭蛋（使用苏丹红，2006）”、“多宝鱼（药物残留，2006）”等。 “配合饲料有毒”、“配合饲料生产的肉蛋奶不能吃”、“小孩肥胖原因是吃了含激素的肉”。,一、概述,饲料安全等于畜产品安全！,2/2/2018 8:53 AM,4,都是药残惹的祸！,苏丹红,三聚氰胺,疯牛病二恶英瘦肉精三聚氰胺苏丹红（红心鸭蛋）孔雀石绿（水产品）抗生素等药物残留,2/2/2018 8:53 AM,5,“饲料鸡”,“土鸡”,新概念鸡蛋全是“扯蛋”？,2/2/2018 8:53 AM,6,9 饲料中有毒有害物质的测定,（三）饲料卫生标准强制性国家标准 对饲料中有独有害物质及有害微生物以法律形式做出的统一规定。 1991年版饲料卫生标准：覆盖面较小，造成许多事故纠纷无判定依据，一些重要的产品卫生指标没有规定等。,一、概述,2/2/2018 8:53 AM,7,9 饲料中有毒有害物质的测定,（三）饲料卫生标准强制性国家标准 2001年新版GB130782001饲料卫生标准： 有害物质及微生物卫生指标项目增加了“铬”在皮革、蛋白粉和鸡、猪配合饲料中的允许量指标。即由原标准规定的16项，修订为17项。新版标准覆盖的产品品种达66种，是原标准的3倍多。砷在磷酸盐产品中的允许量指标由每千克产品10毫克，修订为20毫克。氟在磷酸氢钙产品中的允许量指标由每千克2000毫克，修订为1800毫克。黄曲霉毒素B1指标将肉用仔鸡配合饲料分为前期料和后期料，其允许量分别为每千克饲料中10微克和20微克。补充规定了与各项指标相对应的试验方法，消除了原标准没有指明特定试验方法的缺陷。,一、概述,2/2/2018 8:53 AM,8,9 饲料中有毒有害物质的测定,（三）饲料卫生标准强制性国家标准现行的饲料卫生标准将进行不断的修订和完善！相对于发达国家的饲料卫生标准，我国的饲料卫生标准项目偏少。新农药的不断出现（现行饲料卫生标准只规定了两种农药的限量标准：六六六、滴滴涕）。敌敌畏 、敌百虫 、甲胺磷 、菊酯类 、马拉磷 、蚜螨磷安全限量标准草案。 测定方法灵敏度的提高，对于某些有毒有害物质限量的规定将可能发生改变。新饲料资源的开发利用。,一、概述,2/2/2018 8:53 AM,9,9 饲料中有毒有害物质的测定,（四）饲料中有毒有害物质的分类1. 按来源分： 天然：棉酚、硫甙、脲酶、胰蛋白酶抑制剂等 次生：微生物次生代谢产物，如黄曲霉毒素B1、由氨基酸产生的组胺、尸胺、腐胺、精胺等 外源性：重金属污染，2 按性质分： 有机：棉籽饼粕、菜籽饼粕、蓖麻饼粕中的蓖麻毒素和蓖麻碱、四 季豆中的皂甙（皂素）和胰蛋白酶抑制剂等，病原微生物、霉菌毒素、有机农药等。 无机：铅、砷、铬、镉、汞、氟、钼等。,一、概述,2/2/2018 8:53 AM,10,9 饲料中有毒有害物质的测定,砷的毒性：砷与动物体组织中酶的巯基结合使之失活，损害机体全身组织。砷的氧化物毒性很高，三价砷毒性五价；无机砷毒性有机砷：砒霜（As2O3 ）。一般情况下，植物性饲料砷含量很低。植物饲料中砷含量与土壤中的水平、农药污染和工业污染有关。,二、饲料中总砷的测定（P248）,2/2/2018 8:53 AM,11,9 饲料中有毒有害物质的测定,二、饲料中总砷的测定,有机砷饲料添加剂：对氨基苯砷酸（阿散酸）、对氨基苯砷酸钠和3-硝基-4-羟基苯砷酸 （洛克杀生 ）。 促生长，抗球虫及着色（使皮肤红润，毛色发亮）等功效。我国制定的饲料中砷测定标准方法是测定饲料中总砷含量（目前的检测方法还不能区分有机砷和无机砷），而卫生标准中砷的限量标准为无机砷，造成了使用有机砷添加剂的配合料，含砷量超过我国国家允许量标准，这也使得检测结果无法依据产品卫生标准进行质量判定。,2/2/2018 8:53 AM,12,9 饲料中有毒有害物质的测定,二、饲料中总砷的测定,2/2/2018 8:53 AM,13,9 饲料中有毒有害物质的测定,（一）概述黄曲霉毒素（aflatoxins, AF）是由一组真菌（黄曲霉、曲霉等）产生的一组化学结构类似的真菌毒素。主要污染花生、玉米、棉籽及其饼粕等。对人和动物均具有极强的毒性和致癌性。黄曲霉毒素还可在动物产品中蓄积，影响人体健康。目前已分离鉴定出12种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。其中黄曲霉毒B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。在自然条件下，饲料污染的黄曲霉毒素主要为AFB1、B2 、G1 、G2，其中以AFB1含量最高。黄曲霉毒素的毒性、致癌性和蓄积性饲料产品质量控制中的必检项目。,二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定,2/2/2018 8:53 AM,14,9 饲料中有毒有害物质的测定,(二)检测方法酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）薄层层析法（thin layer chromatography，TLC）快速筛选法,二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定（P288）,2/2/2018 8:53 AM,15,9 饲料中有毒有害物质的测定,酶联免疫吸附法1、原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。 特点：很强的特异性：建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上。 很高的灵敏度：酶催化反应。对于黄曲霉毒素B1，ELISA法最低可检出0.1g。,二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定,2/2/2018 8:53 AM,16,9 饲料中有毒有害物质的测定,酶联免疫吸附法 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。,二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定,2/2/2018 8:53 AM,17,酶联免疫吸附法A、抗体将某种抗原经各种途径免疫动物，成熟的B细胞克隆受到抗原刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。实际上血清中的抗体是多种单克隆抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。,9 饲料中有毒有害物质的测定,2/2/2018 8:53 AM,18,单克隆抗体是由生长在细胞培养物中的同一B细胞的群体（一个克隆）合成并分泌的、均一的、识别同一抗原表位的抗体。,2/2/2018 8:53 AM,19,酶联免疫吸附法B、酶与底物：在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根过氧化物酶底物：邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸终止酶反应。碱性磷酸酶底物：一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)作为底物，用NaOH终止酶反应。,9 饲料中有毒有害物质的测定,2/2/2018 8:53 AM,20,酶联免疫吸附法B、酶与底物：在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根过氧化物酶底物：邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸终止酶反应。碱性磷酸酶底物：一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)作为底物，用NaOH终止酶反应。,9 饲料中有毒有害物质的测定,2/2/2018 8:53 AM,21,酶联免疫吸附法ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。,9 饲料中有毒有害物质的测定,2/2/2018 8:53 AM,22,（1） 直接法测定抗原 A. 将抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量抗原量。,2/2/2018 8:53 AM,23,（2）间接法测定抗体A. 将抗原吸附于固相载体表面；B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体；D. 加底物。 测定底物的降解量抗体量。,2/2/2018 8:53 AM,24,（3）双抗体夹心法测定抗原A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量抗原量。,2/2/2018 8:53 AM,25,（4）竞争法测定抗原A.将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,2/2/2018 8:53 AM,26,黄曲霉毒素B1酶联免疫竞争检测法,2/2/2018 8:53 AM,27,样品,黄曲霉毒素B1分子,2/2/2018 8:53 AM,28,微 孔 表 面 情 况,AFB1抗体,2/2/2018 8:53 AM,29,标准品,2/2/2018 8:53 AM,30,标准溶液,2/2/2018 8:53 AM,31,酶标抗原,2/2/2018 8:53 AM,32,酶标抗原,酶,AFB1,2/2/2018 8:53 AM,33,标准品, 样品 和 酶标抗原加进微孔,2/2/2018 8:53 AM,34,样品,酶标抗原,样 品 孔,先加,后加,2/2/2018 8:53 AM,35,标准品,酶标抗原,标 准 孔,先加,后加,2/2/2018 8:53 AM,36,孵育30分钟,抗 原 与 抗 体 结 合,2/2/2018 8:53 AM,37,微 孔 清 洗,2/2/2018 8:53 AM,38,洗涤5次，间隔2分钟,2/2/2018 8:53 AM,39,加入酶催化反应底物,2/2/2018 8:53 AM,40,加入反应底物A和B,孵 育 15 分 钟,2/2/2018 8:53 AM,41,显 色,2/2/2018 8:53 AM,42,2/2/2018 8:53 AM,43,反 应 孔,2/2/2018 8:53 AM,44,阴 性 对 照 孔,2/2/2018 8:53 AM,45,阴性对照孔=没有黄曲霉毒素B1分子与酶标抗原竞争所有抗体都与酶标抗原结合,2/2/2018 8:53 AM,46,阳 性 对 照 孔,2/2/2018 8:53 AM,47,1 ng/ml 标准孔 = 黄曲霉毒素B1分子结合到抗体上剩余的抗体再与酶标抗原结合,2/2/2018 8:53 AM,48,阳 性 样 品,酶标抗原结合得越少，颜色越浅,2/2/2018 8:53 AM,49,加入终止液，反应液由蓝色变成黄色，上酶标仪读取数据，画标准曲线,2/2/2018 8:53 AM,50,调零孔,阴性孔,0.1 ng/ml,0.5 ng/ml,1 ng/ml,5 ng/ml,10 ng/ml,酶联免疫竞争法标准曲线,0.1,1,10,ng/ml,O.D.,2/2/2018 8:53 AM,51,不同温度条件下的标准曲线,0.1,1,10,ng/ml,O.D.,调零孔,阴性孔,0.1 ng/ml,0.5 ng/ml,1 ng/ml,5 ng/ml 10 ng/ml,2/2/2018 8:53 AM,52,以相对吸光度值为纵坐标三种不同温度下的标准曲线Y=A/A阴性孔,0.1,1,10,ng