次氯酸临床研究及使用进展

336 2015 年 12 月 第 1 卷 第 4 期 次氯酸临床研究及使用进展 顾峥嵘，陈晓，翁蔚宗，曹烈虎，苏佳灿 上海长海医院创伤骨科，上海 200433 摘要 次氯酸（HOCl）作为消毒剂被广泛用于日常生活中，人体内内源性 HOCl 是中性粒细胞来源的髓过氧化物酶与过氧 化氢（H2O2）共同作用下氯离子发生氧化反应产生的，是一种天然、广谱、速效、低浓度时无毒的抗微生物剂，本文综述 了低浓度 HOCl 的临床研究和使用，讨论了 HOCl 作为防治组织感染外用杀菌消毒剂的潜在可行性。 关键词 次氯酸；消毒；抗感染；细胞毒性 中图分类号 R979.7 文献标志码 A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.04.08 Clinical application of hypochlorous acid GU Zhengrong, CHEN Xiao, WENG Weizong, CAO Liehu, SU Jiacan Department of orthopedics trauma, Shanghai changhai hospital, Shanghai 200433, China Abstract As a common disinfection agent, hypochlorous acid is widely used in daily life. Then endogenous hypochlorous acid is produced through the interaction of H2O2 and Chloride ion with the presence of myeloperoxidase from the neutrophils. Hypochlorous acid is a natural anti-microbial agent with broad spectrum, quick acting and low cytotoxicity under low concentrations. This review summarized the clinical study and application of hypochlorous acid. Keywords hypochlorous acid; disinfection; anti-infection; cytotoxicity 1847 年 Ignaz Philipp Semmelweis 医师在维也纳总医 院产科 II 病房发现漂白粉（次氯酸钠）溶液洗手后，新 生儿的败血症的发生率显著下降，同时他认为，用漂白 粉洗手可以减少妇科检查感染及产妇热。虽然当时不被 同行认可，但是如今外科手术洗手消毒已经成为常识。 可以说，次氯酸（HOCl）是开创了外科消毒的先河，具 有里程碑式的意义。但是漂白粉对皮肤的刺激性也限制 了其作为外用消毒杀菌剂的应用。 1 次氯酸作为杀菌剂的一般特征 次氯酸（HOCl）是氯气溶解于水时形成的一种弱 酸。在工业上，HOCl 作为家用漂白剂和清洁剂中的活 收稿日期：2015-10-21；修回日期：2015-11-08 基金项目：国家自然科学基金（31271031）；国家自然科学基金国际重大合作项目（8141101156）；上海市科学技术委员会基础 重点项目（11JC14163020） 作者简介：顾峥嵘，在职研究生，研究方向为创伤骨科，四肢及脊柱软组织疼痛和脊髓损伤，电子信箱：13916577278163. com；苏佳灿（通信作者），副教授，副主任医师、硕士研究生导师，电子信箱：Jiacansu 引用格式：顾峥嵘，陈晓，翁蔚宗，等 . 新一代重离子束治癌的最佳束流选择 J. 世界复合医学，2015,1（4）：336-339 性成分而广为人知。在生物学系统中，HOCl 可被视为 白细胞例如中性粒细胞和单核细胞产生的毒性最强、丰 度最高的氧化剂。HOCl 是中性粒细胞来源的髓过氧化 物酶与过氧化氢（H2O2）共同作用下氯离子发生氧化反 应产生的。细胞利用 O2并使用线粒体膜结合酶 NADPH 酶将其转换为过氧化氢（H2O2）。然后，髓过氧化物酶 催化 H2O2与 Cl- 之间的反应生成 HOCl。定量分析结果 表明，2-h 的孵育时间内，106个活化的中性粒细胞可以 产生约 210-7 mol HOCl1；从化学计量学的角度来讲， HOCl 基本上全部是这些炎症细胞生成的 H2O2导致的。 因此，中性粒细胞中 HOCl 的产量是非常可观的，106 个中性粒细胞产生的 210-7 mol HOCl 足以在几毫秒内 * 论著复合医学基础技术* 顾峥嵘等：次氯酸临床研究及使用进展337 破坏 1.5 亿个大肠杆菌 1。事实上，HOCl 是一种极强的 氧化剂，可迅速攻击多种生理学相关的分子，包括硫醇、 硫醚、胺类、氨基酸、核苷酸、抗坏血酸和多烯酸 1-3。 并且，HOCl 可生成反应性非常高的其他氧化剂，例如与 H2O2和超氧阴离子反应可分别生成单线态氧和羟基自由 基 1,2。 可以认为，HOCl 作为防御性杀菌剂的主要优势在 于没有针对含氯氧化剂的直接酶促防御机制，因此细菌 或者哺乳动物细胞均不能通过催化反应的方式迅速解除 HOCl 的毒性（它们可通过这种方式解除中性粒细胞生成 的其他氧化剂的毒性，例如超氧化物和 H2O2）。 2 HOCl 能灭活毒素和超抗原 HOCl 除具有抗微生物活性外还可以产生有益效应， 引起生物膜破坏，穿透微生物细胞 4、孢子壁和阿米巴 包囊 5 以及促进伤口修复及组织再生。6HOCl 和氮 - 氯 胺对抗病原体的作用机制是快速氧化修饰细胞外和细胞 内成分，诸如导致细菌功能障碍和死亡的硫醇、芳族基 和胺类。7,8铁硫蛋白的灭活极其迅速，按降序排列为 胡萝卜素、核苷酸、卟啉类和血红素蛋白。含重要半胱 氨酸的酶灭活有效性与其巯基的亲核反应性大致平行。9 纯 0.01%HOCl 溶液即使予以大量稀释 1000-100000 倍后 也能快速灭活金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌毒素。氨基 化合物反应后产生氯胺，后者保留 HOCl 的氧化能力， 但反应性降低而更加长久。10这类化合物的一个重要代 表氮 - 氯胺及其类似物显示可以灭活致病因子（即白色 念珠菌和都柏林念珠菌的分泌型天冬氨酸蛋白酶以及烟 曲霉的胶霉毒素）。11 3 低浓度次氯酸无细胞毒性 Kim 等在细胞毒性试验中，采用 HOCl 处理第 2 代 正常人鼻腔上皮（NHNE）细胞 30 min 或者 2 h 后，细 胞未表现出任何毒性迹象。另外，采用 3.5 ppm HOCl 处 理后，采用了扫描电镜和光学显微镜来观察 NHNE 细胞 的形态学变化。对照研究中（处理前），NHNE 细胞是 健康的，具有高度分化的纤毛，细胞 - 细胞之间的完整 性正常。处理 30 min 后，观察到了高度分化的纤毛和良 好的细胞 - 细胞完整性。并且，即使处理 2 h 后，和对 照相比，也未观察到形态学方面的变化。同时发现，低 浓度 HOCl 对正常人鼻腔上皮细胞中分泌性粘蛋白基因 表达的无影响，实验比较了处理前、处理 30 min 和 2 h 后 Muc2、Muc5B、Muc5AC、Muc6、Muc7、Muc8 和 2 微球蛋白基因的表达情况，结果表明，采用 3.5 ppm HOCl 处理的情况下基因表达没有差异。根据这一观察结 果，有理由相信低浓度 HOCl 处理不会影响分泌性粘蛋 白基因的 mRNA 水平。 Brookdale 眼科诊所 13 已在动物模型中证明 NVC- 101 无刺激性和无致敏性。新西兰白兔单次滴入浓度为 0.01，0.03和 0.1 w/v 的 NVC-101 后，没有证据表 明眼部刺激。每 8 h 往荷兰有色兔眼睛滴入开发制剂， 为期 72 h 后未观察到眼刺激（数据未列出）。在一项 Buehler 设计的标准豚鼠皮肤致敏研究中，没有证据表明 浓度为 0.01、0.03和 0.1 w/v 的稳定型 HOCl 引起 皮肤反应，见表 1。 在大鼠和小型猪为期 28 天的毒性研究中，每日敷 0.01、0.03和 0.1 w/v 稳定型 HOCl 封闭敷料 24 h 未见全身毒性。此外，显微镜检查伤口区域显示有预期 的伤口迹象及后续伤口修复。13 表 1 在 4 个不同动物物种中对照品 vs. 稳定型 HOCl 的安全性研究 研究物种给药部位NVC-101（ w/v）结果 眼刺激家兔眼，Q8，72h 生理盐水 0.013 聚维酮碘 无刺激 无刺激 进展性刺激 眼刺激家兔眼睛，单次滴入 生理盐水 0.01、0.03 和 0.1 无刺激 任何剂量均无刺激 皮肤致敏 Hartley 衍生的白化豚 鼠 皮肤 生理盐水 0.01、0.03 和 0.1 无致敏 任何剂量均无致敏 28 天毒性大鼠全层伤口 生理盐水 0.01、0.03 和 0.1 任意剂量均无全身毒性，组织病 理学与伤口愈合一致 28 天毒性荷兰猪全层伤口 生理盐水 0.01、0.03 和 0.1 任意剂量均无全身毒性，组织病 理学与伤口愈合一致 4 次氯酸的临床应用 快速杀菌效果极其显著 13，每个受试细菌 1106 mL-1 的接种量，首次表明了稳定型 HOCl（0.1 至 2.8g/mL） 在 MBC 值时对每个微生物的杀菌速率（表 2）。如此 表中所示，大多数受试微生物在暴露前 2 分钟内被杀 死（99.99）。众多受试细菌物种当中，酿脓链球菌 338 2015 年 12 月 第 1 卷 第 4 期 49399 是唯一的例外，它在相同试验条件下需要大约 10 分钟暴露方能有效杀死。 Kim12 等采用具有杀菌作用的 HOCl 溶液而非传统 的生理盐水进行鼻腔冲洗，发现 HOCl 含量低于 3.5 ppm 的鼻腔冲洗液对鼻腔粘膜没有毒性作用，对各种病原菌 的杀菌作用达到了 99% 以上，因此适用于罹患各种鼻腔 疾病的患者。 Crew14 报道了综合负压伤口疗法（NPWT）和纯 HOCl 溶液 0.01%（NeutroPhase， NovaBay Pharmaceuticals Inc， Emeryville， CA）辅助冲洗治疗急性坏死性筋膜炎 避免了截肢及全身中毒反应，Crew 认为其疗效是基于 0.01% 纯 HOCl 溶液快速杀灭细菌以及推测灭活毒素和 超抗原对患者的治愈发挥重要作用。同时指出，冲洗液 能在体外灭活细菌毒素。 5 讨论和展望 综上所述，HOCl 是一种天然、广谱、速效、低浓 度时无毒的抗微生物剂，是在机体对感染发生部分先天 反应时由中性粒细胞和单核细胞产生的。除了直接穿透 细菌、孢子和阿米巴包囊，次氯酸已显示能破坏生物膜。 另外描述称 HOCl 用作杀菌剂的效力是同等摩尔比次氯 酸阴离子的 80-100 倍。这是因为，纯 HOCl 作为不带电 荷的物质能穿透微生物细胞和孢子壁，而带电荷的次氯 酸阴离子不能穿透细胞壁。HOCl 对革兰氏阳性和革兰氏 阴性病原体（包括耐药菌，如 MRSA、万古霉素中介耐 药性金黄色葡萄球菌和莫匹罗星耐药金黄色葡萄球菌） 具有广谱抗菌活性， 最小杀菌浓度在0.1-2.8g/mL之间， 对白色念珠菌和黑曲霉素也具有杀真菌活性。 另一方面， 由于其理化特性 HOCl 浓度会随着时间的推移而下降， 这就意味着需要维持恰当的用药时间才能发挥最大效应。 Feldman 等 15 研究表明，当 HOCl 的浓度高于 100 M （约 5.25 ppm）时，可观测到具有统计学显著性的纤毛运 动变慢和纤毛运动障碍。Morris 等 16 测定了经过氯气和 次氯酸钠气溶胶（约 0.8 ppm）处理后的一只小鼠的气道 阻力的变化，结果表明气道阻力显著升高。所以 HOCl 在各个不同器官组织的有效安全浓度还等待进一步的研 究。由于细菌对抗生素仍在继续形成耐药性，使用外用 抗菌药的争论仍持续存在，因此研究和开发新一类安全、 广泛有效、具有低毒性、引起抗生素耐药性低的抗菌药 需求必然成为关键。目前，卫生和公众服务部门不建议 使用广谱外用抗生素治疗无法愈合的伤口或有感染风险 的伤口 17。这些建议基于下列原因：抗生素可能引起过 敏反应；尤其当局部给药时可能具有较低组织分布；对 内源性菌群的影响更大（正常共生菌群紊乱）；诱导性 耐药性；最终降低治疗效果。出于同样原因，也不鼓励 使用抗菌药，因为其毒性较高、潜在形成耐药性（如抗 生素），而且更重要的是对伤口愈合过程有直接影响。 根据 HOCl 已发表的结果和本研究获得的数据，有足够 令人信服的证据表明一定浓度的 HOCl 稳定制剂，它类 似于氧化爆发（抵御微生物入侵的一种天然防御过程） 过程中由嗜中性粒细胞产生的 HOCl 分子）可安全和有 效治疗感染。对于开发伤口护理策略的临床医生以及希 表 2 室温下稳定型 HOCl 在 MBC 浓度下针对不同病原体的杀菌时间 病原体 杀菌时间（分钟），回收 CFU/mL102（N=3） 01251015306090 大肠杆菌 25922000000000 铜绿假单胞菌 27853000000000 金黄色葡萄球菌 292136000000000 表皮葡萄球菌 12228000000000 藤黄微球菌 7468000000000 棒状杆菌 49368000000000 流感嗜血杆菌 49144000000000 奇异变形杆菌 14153a000000000 人型葡萄球菌 27844000000000 溶血葡萄球菌 29970000000000 腐生葡萄球菌 35552000000000 肺炎克雷伯菌 10031000000000 粘质沙雷氏菌 14756000000000 化脓性链球菌 4939930030030030030052000 产气肠杆菌 51697000000000 白色念珠菌 10231000000000 黑曲霉 164043001200000000 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 3359130000000000 耐万古霉素肠球菌 5155930000000000 大肠杆菌 25922000000000 顾峥嵘等：次氯酸临床研究及使用进展339 望开发和扩展体外伤口护理制剂人员是一种非常有前途的外用化学药物。 1 Weiss S. J. (1989) Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med,320:365,376. 2 Halliwelt B. and Gutteridge J. M. C. (1989) Free Radicals in Biology and Medicine. Clarendon Press, Oxford. 3 Eaton J. W. (1993) Defenses against hypochlorous acid: Parrying the neutophils rapier thrust. J. Lab. Clin. Med,121:197-198. 4 LeChevallier MW, Cawthon CD, Lee RG. Inactivation of biofilm bacteria. Appl Environ Microbi ol.,1988,54(10):2492-2499. 5 Young SB, Setlow P. Mechanisms of killing of Bacillus subtilis spores by hypochlorite and chlorine dioxide. J Ap plMicrobiol.,2003,95(1):54-67. 6 Selkon JB, Cherry GW, Wilson JM, Hughes MA. Evaluationof hypochlorous acid washes in the treatment of chronicvenous leg ulcers.J Wound Care, 2006,15(1):33-37. 7 Peskin AV, Winterbourn CC. Kinetics of the reactions ofhypochlorous acid and amino acid chloramines withthiols, methionine, and ascorbate. Free Radic Biol Med,2001,30(5):572-579. 8 Yoon J, Jekle A, Najafi R, et al. Virucidal mechanism of actionof NVC-422, a novel antimicrobial drug for the treatment ofadenoviral conjunctivitis.Antiviral Res,2011,92(3):470-478. 9 Albrich JM, McCarthy CA, Hurst JK. Biological reactivity ofhypochlorous acid: implications for microbicidal mechanisms of leukocyte myeloperoxidase.Proc Natl Acad Sci USA,1981,78(1):210-214. 10 Nagl M, Hess MW, Pfaller K, Hengster P, Gottardi W. Bactericidal activity of micromolar N-chlorotaurine: evidence forits antimicrobial function in the human defense system. Antimicrob Agents Chemother,2000,44(9):2507-2513. 参考文献（References） 11 Gottardi W, Nagl M. N-chlorotaurine, a natural anti- septicwith outstanding tolerability. J Antimicrob Che- mother,2010,65(3):399-409. 12 Kim HJ , Lee JG , Kang JW, Cho HJ, Kim HS, Byeon HK Yoon JH. Effects of a low concentration hypochlorous Acid nasal irrigation solution on bacteria, fungi, and virus. The Laryngoscope 2008 ct,118(10):1862-7. 13 Wang L , Bassiri M, Najafi R, Najafi K , Yang J, Khosrovi B , Hwong W , Barati E , Belisle B , Celeri C， Robson MC.Hypochlorous acid as a potential wound care agent: part I. Stabilized hypochlorous acid: a component of