第3章 酶动力学.ppt

酶工程EnzymeEngineering,周海岩牛坤王亚军博士浙江工业大学生物与环境工程学院,酶催化历程,第三章酶促反应动力学,化学反应的两个基本问题：反应进行的方向、可能性和限度反应进行的速率和反应机制,化学热力学,化学动力学,3.1单底物酶催化反应动力学Singlesubstrate/productmodel,Experimentalobservation:Reactionratedependsonhowmuchenzymeisavailable,一级反应动力学,零级反应动力学,当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,随着底物浓度的升高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,当底物浓度达到一定的程度反应速度不再增加；达最大速度；反应为零级反应。,3.1单底物酶催化反应动力学Singlesubstrate/productmodel,Asmentionedearlierwecannotprobeisomerizationofcentralcomplex,soonlyasinglecentralcomplexconsidered.,根据化学反应动力学，反应速率,产物的生成速率还可以表示为，,在推导动力学方程时，对反应机理作3点假设,在反应过程中，酶的浓度保持恒定，即与底物s相比，酶的浓度很低，因此可以忽略由于中间复合物ES形成而消耗的底物s，底物浓度保持在S0；产物的浓度是很低的，因而产物的一直作用是可以被忽略的，不必考虑P+E-ES这个逆反应的存在。,可以简化为，,产物的生产速率为，,1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米氏方程(Michaelisequation)。,S:底物浓度V:不同S时的反应速度Vmax:最大反应速度（maximumvelocity）Ks:米氏常数（Michaelisconstant）,3.1.1快速平衡假设的Michaelis-Menten方程,Michaelis和Menten认为在酶催化反应机理中，酶和底物形成的复合物ES分解生成产物的速率要慢于底物和酶生成复合物的逆反应的速率，即k+2k-1。因此，生成产物的速率决定整个酶催化反应的速率，而生成复合物的可逆反应很快达到了平衡状态，因此，又称为“快速平衡”假设，即是一个快速平衡反应。,E-游离酶的浓度，mol/l;S-底物的浓度，mol/l;ES-酶底物复合物的浓度，mol/l;KS解离常数，mol/l,Massactionandconservationlaws,E0-酶的总浓度，酶的初始浓度，mol/l;,在很高的底物浓度时，全部的酶几乎都呈复合物状态，此时产物生成速率v达到最大反应速率vmax,vmax-产物P的最大生成速度，mol/(ls);E0-酶的总浓度，酶的初始浓度，mol/l;KS解离常数，单位与底物S的单位相同mol/l,快速平衡假设方程（M-M）的缺陷,虽可解释一些实验事实，但不具有普遍适用性。当酶促反应速度很快，会破坏该方程的前提条件“快速平衡”的假设。,3.1.2“拟稳态”假设的Briggs-Haldane方程,Briggs和Haldane针对M-M方程引入了更为普遍的假设：由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高很多，中间复合物的浓度很低，除了反应的最初期，其浓度维持不变，即中间复合物生成速率与解离速率相等，ES不随时间而变化，这就是“拟稳态”假设。,3.1.2“拟稳态”假设的Briggs-Haldane方程,对中间复合物ES采用“拟稳态”假设，,TheMichaelisconstant,KM,isdefinedas,3.1.2“拟稳态”假设的Briggs-Haldane方程,快速平衡法与稳态法的比较,理论最大反应速率(theoreticalmaximalvelocity)Vmax,Vmax是一个常数；Vmax是理论最大反应速率，实际很难达到；要达到Vmax要求所有的酶分子与底物紧密结合；随着底物浓度增加，反应速率逼近Vmax。,3.1.3对M-M方程的讨论,ThekineticactivatorconstantKM是一个常数；KM是一个源于反应速率常数的常数；KM近似衡量酶对底物的亲合力：小KM值说明结合紧密；大KM值说明结合弱；如果k+2很小，那么KMKS,kM,常见酶的KM值,常见酶的KM值,AnothermeaningofKM,i.e.KM=substrateconcentrationatwhichreactionrate=1/2maximum,Saturationkineticexperiments(right)aresocalled,becausethroughKMorVmaxtheyprobehowmuchSisrequiredtosaturateE.,Ameasureofcatalyticactivity转换数，周转数(turnovernumber,TNorkcat)：每秒钟或每分钟，每个酶分子最多能转换底物的分子数，或每秒钟或每分钟每摩尔酶最多能转换底物的摩尔数。如果符合M-M模型，kcat=Vmax/E0=k+2周转数反映酶活力；Kcat数值范围1/sec几百万/sec。,周转数kcat,是一个等双曲线方程，有两条渐进线,Thecatalyticefficiency:kcat/KmAnestimateofhowperfecttheenzymeiskcat/KM是一个表观二级反应速率常数；衡量在低底物浓度条件下酶的催化表现；kcat/KM上限是扩散限制(diffusionlimit-therateatwhichEandSdiffusetogether);小分子的最大扩散速率是109M-1sec-1。,kcat/KM定义酶的催化效率(CatalyticEfficiency),*numberofsubstratemoleculestransformedpersecondpermoleculeofenzyme,kcat/KM定义酶的催化效率(CatalyticEfficiency),当底物浓度相对较低时，酶促反应处于一级反应动力学，,如果酶作用于2种底物，即S1和S2,酶选择性,当S1=S2时，,衡量酶对底物的专一性：,反应初速率v对底物浓度S作图,需要的材料与方法：酶底物测定底物消耗或者产物生成的分析方法,3.1.4酶催化反应动力学参数求取,vo对S作图不能给出精确的动力学参数Plotofvovs.S,酶催化反应动力学参数求取,1.双倒数Lineweaver-Burke图,LinearPlotsCanBeDerivedfromtheMichaelis-MentenEquation,Lineweaver-Burk双倒数作图,Lineweaver-Burk方程,要获得准确的结果，实验时必须注意底物的浓度，一般选择在KM值附近。,底物浓度,2.Hanes-Woolf法（简称H-W法）,两边同乘以S,Hanes-Woolf作图法的优点是允许底物浓度S处于低浓度范围。,4.Eadie-hofstee法,5.Eadie-Scatchard法,Pseudo-steadystateassumption,Rateequation,Generalformexpressedwithrateconstants.Simplifytoexpresswithobservableconstants.,Introduce:Keq,Introduce:KSandKP,KSandKPareMichaelis-Mentenconstants,Specialcases,InitialrateexperimentwithP0=0:S0,SS0,P0,Irreversibleenzyme:k-2=0,3.2降低酶催化反应速度的因素,1.失活作用2.抑制作用3.去激活作用4.阻遏作用,失活作用,失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。,抑制作用,抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。,去激活作用,去激活作用，某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也会引起这些酶活性的降低或丧失。,阻遏作用,阻遏作用指某些因素（如激素或药物等）使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化.,抑制程度的表示,一般用反应速度的变化来表示。若以不加抑制剂时的反应速度为Vo，加入抑制剂后的反应速度为VI，则酶的抑制程度有下列几种表示方法：,抑制程度的表示,1酶的活力分数（残余活力分数）,3抑制分数指被抑制而失去活力的分数,2相对活力百分数（残余活力百分数）,4抑制百分数通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。,3.3酶催化反应的抑制动力学,1.可逆抑制作用（竞争性抑制作用，非竞争性抑制作用，反竞争性抑制作用，混合型抑制）2.不可逆抑制作用（非专一性不可逆抑制作用；专一性不可逆抑制作用）,可逆抑制作用Reversibleinhibition,可逆抑制作用：抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理的方法除去抑制剂而使酶恢复活性的抑制作用。包括：竞争性可逆抑制，非竞争性可逆抑制，反竞争性可逆抑制和混合可逆抑制。各自抑制机制不同，动力学行为不同(kineticbehavior)。,不可逆抑制作用,抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析，超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活者，称为不可逆抑制作用。,1概念2抑制程度的表示3抑制作用的分类4抑制作用的动力学方法鉴别,失活作用抑制作用去激活作用阻遏作用,可逆抑制作用不可逆抑制作用,相对活力分数相对活力百分数抑制分数抑制百分数,竞争性抑制剂与底物竞争酶的活性位点；竞争性抑制剂与底物结构相似；竞争性抑制剂必须扩散离开酶的活性中心以后，底物才能进入酶的活性中心；表观动力学取决于抑制剂的浓度、底物浓度和酶对抑制剂、底物的亲和力。,3.3.1可逆抑制动力学1.竞争性抑制作用Competitiveinhibition竞争性抑制剂是底物的结构类似物，也能与酶的活性中心结合,琥珀酸脱氢酶催化Succinatedehydrogenase,竞争性抑制作用Competitiveinhibition,琥珀酸，丁二酸,丙二酸,富马酸,CompetitiveInhibitionbindingofSandIaremutuallyexclusive相互排斥,对中间物采用“拟稳态”假设，,竞争性抑制剂I与游离酶E结合的解离常数为KI,竞争性抑制作用,MassConservation,竞争性抑制作用,在竞争性抑制剂存在下，最大酶反应速率Vmax保持不变，表观米氏常数KM,app增大至,竞争性可逆抑制作用,Vmax不受竞争性抑制剂存在的影响；表观米氏常数提高了倍。,Y-截距不变(Vmax不变)；斜率随着I浓度增加而增加(1+I/KI)倍；KI=I时，(1+I/KI)=2；反之，(1+I/KI)=2时，KI=I。,y轴截距,二次作图,竞争性抑制双倒数作图,抑制度酶的活力分数,抑制分数,抑制百分数通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。,当,提高底物浓度S，抑制率i%下降;增加底物浓度S可以减轻抑制作用；提高抑制剂浓度I，抑制率i%上升;增加抑制剂浓度I加重抑制作用。,非竞争性抑制剂I、底物S在酶上分别有不同的结合位点；I与酶结合后不影响酶与S的结合；反之亦然viceversa。I、S与酶可逆结合，且相互独立；ESI没有活性，I的结合导致催化中心扭曲、构型改变。,2.非竞争性抑制作用Non-competitiveinhibition,2.非竞争性抑制动力学Non-competitiveinhibition,非竞争性抑制,对中间物采用“拟稳态”分析，,非竞争性抑制,非竞争性抑制,表观最大反应速率下降米氏常数KM不变,非竞争性抑制,随着抑制剂浓度I增加，斜率,也增加；x轴截距,不变；y轴截距,增加，距离原点越来越远。,二次作图,非竞争性抑制双倒数作图,抑制度酶的活力分数,抑制分数,抑制百分数,提高底物浓度S，抑制率i%不变，对抑制作用没有效果。增加抑制剂浓度I抑制作用增强。,I与且仅与ES结合，形成的ESI是没有活性的复合物；在多反应物体系中很常见。,3.反竞争性抑制作用Uncompetitiveinhibition,反竞争性抑制,对中间物采用“拟稳态”假设，,反竞争性抑制,酶量守恒,表观最大反应速率和表观米氏常数都下降相同的倍数。,反竞争性抑制,反竞争性抑制,+Icurvesareparallel,shiftedleftSaturatinginhibitorwilldrivereactionvelocitytozero,二次作图,反竞争性抑制双倒数作图,反竞争性抑制剂浓度I改变时，双倒数直线的斜率不变，所以，不同抑制剂浓度I下，我们得到的是一系列的平行线。x轴截距是，y轴截距是，直线的斜率是随着抑制剂浓度I增加，斜率不变；x轴截距变小；y轴截距增加。+I直线向左平移！,抑制程度反竞争性抑制剂存在时，酶的活力分数,抑制分数,抑制百分数,当,提高底物浓度S，抑制率反而增大，反竞争性抑制剂的抑制作用加剧。但是，随着底物浓度S增加，酶促反应速率也增大！这与后续介绍的底物抑制作用是有区别。增加反竞争性抑制剂抑制剂浓度I抑制作用增强。,4.线性混合型抑制作用Linearmixedinhibition,抑制剂I既能与E结合，又能与ES结合；结合位点在活性中心之外；ESI的解离常数与EI的解离常数呈线性关系。,4个变量，需要4个方程，因此，除酶量守恒公式外，我们还需要3个方程！,对各个中间物采用平衡假说分析，,酶量守恒,一般形式,非竞争性可逆抑制，EI、ESI复合物都存在,特例：,Typesofinhibition-Summary,1/v0,Slope=KM/Vmax,1/Vmax,-1/KM,1/S,1/v0,1/Vmax,-1/KM,1/S,1/v0,1/Vmax,-1/KM,1/S,1/v0,1/Vmax,-1/KM,1/S,Competitive,Mixed,Non-competitive,Uncompetitive,-葡糖