第2章 细菌农药.ppt

1,第二章细菌农药,2,第二章细菌农药,细菌农药包括：细菌杀虫剂和细菌杀菌剂细菌杀虫剂目前大约有100多种，被开发的主要有：苏云金芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和缓死芽孢杆菌细菌杀菌剂包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌研究较多的主要是荧光假单孢杆菌和芽孢杆菌,3,第一节细菌农药概述,一、细菌农药的分类细菌农药：是一类由细菌或其代谢产物组成的杀虫或杀菌制剂其分类可按用途或防治对象和是否产芽孢进行分类,4,1、按用途或防治对象分类,A、细菌杀虫剂是最早的微生物农药，主要是从昆虫病体上分离得到的病原菌。致病菌有：苏云金芽孢杆菌（Bt）、金龟子芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、天幕虫梭菌、铜绿假单胞菌和金龟子立克次氏菌等Bt杀虫晶体蛋白对鳞、双、鞘、膜、同、直翅目、食毛目及线虫、螨类、原生动物等有杀虫活性。,5,B、细菌杀菌剂,早期研究的多为革兰氏阴性菌：假单孢菌、放射形土壤杆菌、欧氏杆菌等。近年来革兰氏阳性菌得到重视，特别是芽孢杆菌应用潜力大。枯草芽孢杆菌对镰刀菌属和丝核菌属防治效果很好，且兼具防病和促进作物生长的作用蜡状芽孢杆菌用于苜蓿猝倒病、大豆猝倒病和根腐病,6,C、细菌杀线虫剂,是一类可防治植物线虫的细菌。其中穿刺巴斯德氏柄菌是植物线虫最重要的生物防治因子之一。,7,D、细菌杀鼠剂,细菌及其代谢产物在鼠类防治上取得了满意的效果目前主要的细菌杀鼠剂有肉毒梭菌产生的毒素，其中C型肉毒梭菌生物杀鼠素已得到一定范围的应用。,8,E、微生态制剂,又叫活菌制剂、生菌剂、益生素，是在微生态理论指导下，由乳酸杆菌、芽孢杆菌、光合细菌和酵母菌等有益微生物经复合培养、发酵、干燥、加工等特殊工艺生产出的生物制剂或活菌制剂。作用：改善肠道菌群失调、维持肠道微生态平衡、增强机体免疫功能、提高机体搞应激能力。,9,2、按是否产芽孢分类,A、芽孢杆菌类细菌农药主要有：苏云金芽孢杆菌、金龟子芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌B、非芽孢杆菌类细菌农药主要有：铜绿假单孢菌、金龟子立克次氏体、荧光假单孢杆菌、放射型土壤杆菌、欧氏杆菌、穿刺巴斯德氏柄菌、肉毒梭菌、乳酸杆菌、光合细菌和酵母菌,10,二、细菌农药的特点,选择性强、对人畜等生物比较安全、对环境相容性高通常对害虫天敌安全、不容易产生抗性容易培养、培养时间短、生产工艺比较简单产芽孢的细菌农药抗逆性强、易于贮存和运输开发和登记费用低于化学农药,11,第二节苏云金芽孢杆菌杀虫剂,一、特征和分类,1、形态和培养特征,12,芽孢囊,芽孢着生于细胞的一端或偏一端，另一端或两端形成一个、两个或多个不同形态的伴孢晶体。当芽孢囊成熟时，通常芽孢与伴孢晶体分离但有些亚种当芽孢破裂时芽孢和伴孢晶体却包裹在芽孢外壁内,13,芽孢和伴孢晶体,芽孢的形状和大小较固定伴孢晶体的形状和大小与菌株本身的特征、培养基和培养条件的差异而不同有些菌株的伴孢晶体是由S层蛋白形成的Bt的24个亚种及其33个菌株的伴孢晶体大小：长度为0.6-1.8um，宽为0.3-0.9um形状为：菱形、长菱形、圆或椭圆形、镶嵌形、无定形、三角形等。,14,培养特征1：菌落,培养特征是微生物固有的特征，但Bt的培养特征却依培养基、培养条件和培养时间的不同而不同Bt在蛋白胨琼脂培养基中30度培养24h，形成针尖大小的小点，边缘平滑。72h后为圆盘状，直径约1cm，淡黄色而湿润，边缘不整齐，略呈放射状皱纹。Bt在2%的葡萄糖琼脂培养基中30度培养24h，可见黄色小菌落，48h后成厚圆环形，直径约3mm，中央有一较深的圆环，表面为暗白色，边缘有复片如卷发，72h后直径达2cm,15,培养特征2：菌苔,Bt在斜面上的菌苔呈凸突状，乳白色或淡黄色，光滑或有皱纹蜡螟亚种在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基中30度培养14-16h，菌苔稀薄，为乳白色带黄，表面无光泽；72小时后，菌苔丰满，有光泽，有时有皱纹,16,2、分类,亚种划分鉴定方法归纳为以下几种：1、鞭毛抗原的血清型（H抗原）一个细胞的鞭毛往往有一到多个抗原，含有抗体的血清能与抗原发生特异性反应2、营养细胞的脂酶型根据酯酶带的数量、特征和E1值的不同，把Bt分为24个酯酶型3、O-血清型H型鉴定方法所制备的抗原为OH抗原,17,二、作用机制,Bt产生的毒素有：伴孢晶体（杀虫晶体蛋白：晶体蛋白和溶细胞蛋白）、苏云金素、营养期杀虫蛋白、几丁质酶、卵磷脂酶、肠毒素等1、晶体蛋白（Cry）的作用机制作用过程：昆虫肠道溶解酶解活化与受体结合膜孔形成细胞裂解,18,昆虫肠道溶解：伴孢晶体溶解释放出晶体蛋白毒素释放和激活：晶体蛋白Cry1Ac的C末端切除7个8-10k短肽，N末端切除28个氨基酸得到抗蛋白酶的60k毒素核心片段毒素与受体结合：穿过围食膜到达中肠上皮柱状细胞，与刷状缘上特异性的受体高亲和性地结合。杀虫特异性与亲和力大小相关,晶体蛋白（Cry）的作用过程,19,晶体蛋白（Cry）的作用过程,细胞膜孔的形成：与特异性受体结合后，毒素会快速而不可逆地插入细胞质膜中细胞裂解：形成孔洞后，维持细胞膜功能的离子梯度破坏，不能渗透细胞内外的一些大分子和水分子，导致柱状细胞吸水膨胀，最后裂解,20,2、溶细胞蛋白（Cyt）的作用机制,CytA的大小和结构与Cry蛋白完全不同，作用机制也不同。CytA在细胞膜上没有专一的受体蛋白它首先与膜中的不饱和脂肪酸亲和而与膜结合，而且是通过多个毒素分子寡聚合形成跨膜的-桶式结构，最后造成膜穿孔,21,3、营养期杀虫蛋白（VIPs）作用机制,主要通过与敏感昆虫中肠上皮细胞受体结合，使中肠溃烂而产生昆虫致死现象致病作用与杀虫晶体蛋白相似，但作用机制完全不同,22,4、苏云金素的杀虫机理,A、是RNA聚合酶的特殊抑制剂，及抑制RNA合成过程，但不影响蛋白质和DNA合成B、可能是与ATP竞争酶的结合位置，影响靶标生物的ATP代谢作用C、真核生物DNA依赖的RNA聚合酶对苏云金素更敏感D、对真核生物的代谢作用产生干扰，影响肠道合成核糖体的RNA核聚合酶,23,三、基因工程菌,1、Bt杀虫晶体蛋白基因1981年第一次克隆了Bt杀虫晶体蛋白基因cryl1Aa1除部分杀虫晶体蛋白基因可能定位于染色体上外，绝大多数的杀虫晶体蛋白基因定位于质粒上。在1995年成立了cry基因命名委员会，根据晶体蛋白氨基酸序列的同源性差异，将已知的基因分为4个等级,24,1、Bt杀虫晶体蛋白基因,A、鳞翅目昆虫特异性的cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac杀虫晶体蛋白B、基因cry1C:用于防治灰翅夜蛾、甜菜夜蛾C、基因cry9C：与其它杀虫晶体蛋白相比具有不同的结合位点D、人工基因：cry1Ab/1C、cry1Ac、cry4B、cry3A、cry1Ab等基因的诱变产物可提高毒力2.5-32倍,25,1、Bt杀虫晶体蛋白基因,E、基因cry3A：对鞘翅目昆虫有特异性毒力F、杀蚊毒素蛋白基因：主要存在于以色列亚种，至少含有：Cry11A、Cry4B、Cry4A、Cyt1A晶体蛋白G、对动植物寄生线虫有毒的基因：cry5、cry6、cry7、cry8、cry12、cry13、cry14、cry21（来自美国），作用对象有短体线虫、原生动物、螨类、吸虫、虱等,26,2、Bt重组杀虫菌,A、基因转移的策略质粒转移：通过质粒的结合转移可以实现杀虫基因的重新组合，从而获得所需的重组杀虫菌整合到染色体上：通过同源重组或转座子介导而整合在染色体上遗传稳定的质粒载体：用一个目标杀虫基因替换Bt同源质粒中与质粒复制无关的DNA片断,27,2、Bt重组杀虫菌,B、苏云金杆菌杀虫工程菌广谱杀虫工程菌：将cry1C导入cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac，扩充后三者对甜菜夜蛾等昆虫的杀虫活性；将cry3A导入库斯塔克亚种，扩充其对鞘翅目昆虫的毒力等,28,B、苏云金杆菌杀虫工程菌,提高杀虫活性的工程菌：1、转录水平-利用基因cry3A的启动子表达基因cry1Ac和cry1C可达到提高表达量；2、转录后水平-基因cry1Ac的终止子和cry3A的STAB-SD序列可用于提高mRNA的稳定性；3、翻译后水平利用帮助蛋白提高晶体蛋白的表达量和稳定性4、协同杀虫活性利用几丁质酶基因增强对莲纹夜蛾、小菜蛾和蚊虫的杀虫活性。,29,B、苏云金杆菌杀虫工程菌,延缓抗性的工程菌：cyt1A基因被认为与蚊虫对Bt以色列亚种不易产生抗性有关，cry9c也被考虑用于克服抗性的研究延长持效期的工程菌：以含有基因cry1Ac且sink-缺陷的Bt菌作受体，一方面具有较高的杀虫活性，另一方面在芽孢形成的晚期受阻，不能完成芽孢形成过程，但并不影响晶体蛋白基因的表达,30,四、制剂生产工艺和应用,1、制剂生产工艺：液体发酵和固体发酵A、液体发酵工艺：菌种的制备、培养基的选择和灭菌、发酵、后期处理发酵控制难题：a、有机体的内在活动是非线性的过程b、几乎不能用动力学模型精确描述其复杂的生化过程c、模型参数具有不可预测性d、可靠的可用来探测细胞内部活动的生物传感器几乎没有,31,苏云金芽胞杆菌制剂生产工艺流程图,32,四、制剂生产工艺和应用,B、固体发酵：是利用小颗粒载体表面吸附的营养物质来培养所需要的微生物固体发酵是高浓度和高黏度发酵技术的极限可克服液体发酵对技术要求高、设备投资大、商品制剂成本高等缺点工艺流程：Bt优质菌粉网盘薄层固体发酵干燥粉碎包装,33,34,四、制剂生产工艺和应用,Bt固体发酵分4个阶段：第一阶段：发酵初期（6-10h）第二阶段：发酵高峰（10-24h）第三阶段：稳定期（24-34h）第四阶段：后熟期（34h-发酵结束）,35,2、应用,a、防治蔬菜害虫b、防治水稻害虫c、防治棉花害虫d、防治玉米害虫e、防治园林及果茶害虫f、防治医学害虫：蚊虫、蚋等g、防治仓贮害虫h、防治动物寄生虫,36,第三节其它细菌杀虫剂,一、球形芽孢杆菌（Bs）1904年确定其做为一个独立的种，1965年发现BsKellen菌株对蚊幼虫有毒杀作用20世纪70年代后各国学者对其进行深入研究,37,1、形态特征和分类,Bs是革兰氏染色可变的、形成内生芽孢的一种杆菌，其培养体的形态随其发育阶段的不同而变化,Bs菌株的营养细胞,38,1、形态特征和分类,Bs的营养细胞由细胞壁、细胞质膜、细胞质、原核、间体、鞭毛等组成Bs对蚊幼虫有有毒菌株和无毒菌株之分大部分无毒菌株营养细胞的细胞壁外层具有正方形的、对称而有规则的结构蛋白质（T层）,39,孢子囊,40,芽孢的结构由外到内：芽孢外膜、外衣、片状中衣、内衣、皮层,41,菌落的形态,Bs的菌落成圆形、一般微突起、表面光滑、油脂样有闪光、有整齐的边缘、呈白色、浅黄色或微棕褐色，少数为粉红色，颜色随时间由浅到深,42,分类,Bs做为一个新的独立种主要依据是形态学和它的表形特征，除此外还有DNA同源性、脂肪酸组成、生化特征Bs种内的鉴定采用DNA同源性分析、H-抗原分析、对噬菌体的敏感性、血清型，将Bs菌株分为5个DNA同源型、48个H-血清型、8个噬菌体型、10个血清型,43,2、活性谱及活性成分,Bs生长发育过程中产生两类不同的蛋白：晶体毒素蛋白和Mtx毒素蛋白所有高毒力株和部分中毒力株在芽孢形成过程中能形成位于芽孢外膜内的伴孢晶体，该晶体由51k和42k（p51和p42）多肽组成，其合成于芽孢形成期，并在芽孢形成III期通过两蛋白的相互作用和折叠而组装成晶体,44,3、作用机制,Bs对各种蚊虫有高毒效的菌株属于血清型H5a5b、H25、H6Bs的毒素对蚊虫的作用机制十分复杂，晶体毒素对敏感幼虫的作用主要包括以下各阶段：a、芽孢晶体复合物被幼虫吞食，b、伴孢晶体在中肠碱性环境下溶解，c、51k和42k原毒素蛋白质被胰蛋白酶和糜蛋白酶降解成43k和39k的多肽，d、毒性肽与胃盲囊和中肠后段结合，e、通过某种方式实现其毒性作用,45,BS对蚊子幼虫的毒性,大,小,中,46,3、作用机制,毒素与尖音库蚊中肠细胞的结合很强烈，具有高度特异性和亲和性，而与按蚊细胞的结合是微弱的，具有非特异性和低亲和性。毒素与埃及伊蚊细胞不结合。这说明：蚊幼虫对毒素敏感性的差别是由于它们与毒素结合的受点不同所致。,47,4、编码毒素基因,Bs与Bt另一个重要的不同点是：它的毒素基因位于细胞的染色体上而不是质粒上迄今为止，毒素蛋白基因的DNA序列和氨基酸序列已经被确定的Bs菌株有2362菌株、1593菌株、IAB59菌株、2317-3菌株和SS-1菌株等。除SS-1菌株的晶体毒素蛋白是1个100k的多肽外，其它菌株均由42k和51k二个多肽组成，且其碱基序列很相似,48,5、基因工程菌,天然的杀蚊蛋白的缺点：持续期较短、杀蚊谱较窄、不能有效地分布于目标昆虫的取食范围如水体表面。可通过DNA重组技术对天然毒素蛋白基因进行修饰和改进，并通过杀蚊基因在不同宿主中的表达研究，获得杀蚊活性增强、持续期延长、杀蚊谱拓宽、不易产生抗性的新型杀蚊工程菌,49,5、基因工程菌,a、Bs杀蚊毒素基因在大肠杆菌和其它芽孢杆菌中的表达：以无蛋白酶活性的突变株为宿主会大大提高毒素的表达水平b、柄细菌工程：将杀蚊基因转入柄细菌中c、灭蚊工程蓝藻：将杀蚊基因转入蓝藻,50,6、制剂生产工艺,少数采用半固体发酵技术，一般采用液体深层发酵技术Bs制剂深层发酵生产工艺一般采用Bt杀虫剂的生产工艺：菌种制作、发酵、后处理、干燥、检测,51,7、应用,我国是Bs应用开发较早的国家之一，1985年就研制出了Bs液剂，并在20个省市大面积使用，同时还研制出了实验性粉剂、缓释颗粒剂1993年我国的Bs制剂产量近100吨，剂型也越来越多使用一吨Bs灭蚊剂比化学灭蚊要节省5000到10000元，且不污染环境,52,二、金龟子芽孢杆菌,1、形态特征,53,2、作用机制,感染过程分为4个时期：a、芽孢萌发期b、营养体繁殖期c、芽孢形成期d、芽孢成熟期,54,3、应用,美国在13个州用日本金龟子芽孢杆菌制剂防治日本金龟子，面积达4万多公顷，防治效果60-80%；美国的马里兰州应用该菌后使每平方米草地上蛴螬从200-600头减少到10-30头，并且保持这个水平达9年之久问题：这种病原细菌不能在人工培养基中生产大量的侵染性芽孢，因此应用受限。,55,三、嗜虫黏质赛氏杆菌,通常它是水、土壤、牛奶和食品中的普通腐生菌，并能引起多种鳞翅目昆虫如：草地螟、玉米螟、黄地老虎、棉铃虫、舞毒蛾等的幼虫。感染后在虫体体腔中繁殖，导致宿主败血症、使其运动缓慢、对外界刺激不敏感、食欲减退、经常腹泻，在1-3天内迅速死亡。,56,四、梭状芽孢杆菌,毛虫吞食后，经16-24h，芽孢在宿主体内萌发成营养体、24h后形成芽孢，36h后便中出现营养和芽孢，5-6天幼虫进入濒死期，4天后死亡特殊点：病原菌仅在肠道中繁殖，并不入侵体腔，虫死后，虫尸收缩、干燥而僵化，不腐败。,57,第四节细菌杀菌剂,一、假单孢菌目前应用的主要有荧光假单胞菌、洋葱假单孢菌和恶臭假单孢菌,58,1、抗菌机理,a、竞争作用：包括营养竞争和位点竞争b、诱导植物系统抗性：一些荧光假单孢菌在概况的定殖能诱导植物对病原菌产生系统抗性，从而抑制微生物的侵染c、抗生作用：荧光假单孢菌通过产生次生代谢物抑制植物病原物的生长,59,2、应用,荧光假单孢菌生防菌株已应用控制一些农业生产中危害严重的土传作物病害：棉花幼苗猝倒病、棉花立枯病、小麦全蚀病、马铃薯软腐病、番茄青枯病、烟草根黑腐病和桃树根癌病,60,二、枯草芽孢杆菌,防治对象主要为丝状真菌引起的植物病害：水稻纹枯病番茄叶霉病大豆根腐病苹果霉心病棉花立枯病棉花枯萎病,61,1、作用机制,a、拮抗作用：是指微生物产生抗菌物质，抑制有害病原菌生长或直接将病原菌杀死。b、竞争作用：以位点竞争为主，在植物体表、体内、根际及土壤中定殖；营养竞争只在少数菌株中发现c、诱导植物抗性作用：诱发植物自身抗病机制从而增强植物的抗病能力,62,2、生产工艺及应用,生产工艺：液体深层发酵和固体发酵应用：玉米浸种，防治幼枯萎病、产量提高、控制仓贮期玉米种腐；喷洒水稻秧苗，水稻纹枯病减轻50-81%，产量大量提高；在枝干和花叶病害的防治中有独特效果，喷洒落叶后的苹果枝条和修剪伤口，大大减少溃疡病的发生；喷洒大豆植株，使大豆锈病菌的锈疱囊少了95%以上。,63,三、地衣芽孢杆菌,对多种动植物及人类病原菌有很好的抑制作用，是植物病害防治中具潜力的细菌之一1、作用机制：通过产生抗菌蛋白、多肽类、几丁质酶、和非蛋白类如苯乙酸等抗菌物质发生作用。此外还具有植物体表定殖竞争能力、诱导植物产生系统抗性能力2、应用：对番茄灰霉病、烟草黑胫病、棉花枯萎病和黄萎病等均有防效,64,第五节、细菌杀线虫剂和杀鼠剂,一、穿刺巴斯德氏柄菌是植物线虫最重要的生物防治因子之一1、分类地位：至今混淆不清，区分该属种的标准有问题2宿主范围和地理分布：目前为止，已经报告有分属于116个属的323个种，分布于五大洲三大洋的70个国家，全世界已有分隶于116个属的323种线虫可作为其宿主。,65,3、生活史和培养方法,孢子的形成分为6个阶段：a、菌丝体末端的细胞拉长并完全分开，b、从内生孢子的母细胞中分出前孢子的横隔膜形成，c、前孢子被内生孢子的母细胞吞没并发生前孢子的原生质凝聚，开始产生副孢纤维，de、髓质、皮质、外孢的形成，f、内生孢子成熟现大量生产穿刺巴斯德氏柄菌的方法是在温室植物的线虫中繁殖这种病原菌,66,4、杀线虫现状,在葡萄、花生、大豆、烟草、番茄和小麦等多种作物上能压低根结线虫的数量能压低百慕大草上的长刺线虫、某些农作物上的燕麦异皮线虫和玉米异皮线虫，水稻上的微褐异皮线虫以及桃树上的叉尾线虫等虫口,67,5、应用前景,商品化生产的主要障碍是缺乏大规模生产的有效技术只有对穿刺巴斯德氏柄菌的营养需要充分了解后才能进行大量培养为了保证充分的营养，需要在性质上与线虫假体腔液的化学成分相似的培养基,68,二、肉毒梭菌,肉毒毒素是肉毒梭菌在生长繁殖过程中产生的一种细菌外毒素。肉毒梭菌是一种厌氧菌，其孢子常规在土壤中，与产生破伤风毒素的细菌属同一科。在合适的条件下（10C，无氧，合适