发酵工程第三章发酵工业原料及其处理PPT课件

第三章发酵工业原料及其处理,发酵工业原料及其处理,第一节发酵工业原料的种类和成分第二节淀粉水解糖的制备第三节发酵培养基灭菌,第一节发酵工业原料的种类和成分,发酵培养基中各种成分的定量工业上常用作碳源的淀粉类原料工业上常用作氮源的蛋白质类原料发酵培养基中的无机盐和生长因子发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂等,一、发酵培养基中各种成分的定量,发酵培养基即要有利于微生物的生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的合成。发酵培养基的组成特点。,发酵培养基的组成特点。,碳源物质添加量远大于种子培养基；氮源添加根据实际情况确定；无机盐是发酵培养基的必须成分，十分重要；生长因子的存在需要精确控制；前体物质必须确定好添加的浓度和时间；促进剂和抑制剂在一定程度上可以帮助发酵。,发酵工业原料的种类和成分,发酵培养基中各种成分的定量工业上常用作碳源的淀粉类原料工业上常用作氮源的蛋白质类原料发酵培养基中的无机盐和生长因子发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂等,二、工业上常用作碳源的淀粉类原料,淀粉的性质：淀粉呈白色无定形结晶粉末；没有还原性，没有甜度，不溶于冷水和酒精；分为直链淀粉和支链淀粉两种结构，遇碘液呈蓝色或紫红色反应。淀粉质原料：含淀粉较高，来源广泛，价格便宜，淀粉质原料及水解液是发酵工业常用的碳源，主要有工业淀粉、谷类、薯类等。工业淀粉包括玉米淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉等，谷类包括大米、高粱、大麦和小麦，薯类则包括甘薯、马铃薯和木薯等。,发酵工业原料的种类和成分,发酵培养基中各种成分的定量工业上常用作碳源的淀粉类原料工业上常用作氮源的蛋白质类原料发酵培养基中的无机盐和生长因子发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂等,三、工业上常用作氮源的蛋白质类原料,发酵工业常用的蛋白质原料主要有黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母膏、鱼粉等。黄豆饼粉用于抗生素发酵、玉米浆用于几乎所有发酵工业、蛋白胨要注意品种选择、酵母粉注意酵母种类、蚕蛹粉用于制霉菌素发酵。各种原料应注意进行合适的选择，对发酵影响较大。,发酵工业原料的种类和成分,发酵培养基中各种成分的定量工业上常用作碳源的淀粉类原料工业上常用作氮源的蛋白质类原料发酵培养基中的无机盐和生长因子发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂等,四、发酵培养基中的无机盐和生长因子,磷酸盐需求量0.005-0.01mol/L，硫酸镁是必须添加的物质，一般浓度25-90mg/L，钾盐需求量约为0.1g/L，微量元素在使用天然碳氮源时不需另外添加，生长因子在特殊生产过程中需要添加，一般由碳氮源提供。,发酵工业原料的种类和成分,发酵培养基中各种成分的定量工业上常用作碳源的淀粉类原料工业上常用作氮源的蛋白质类原料发酵培养基中的无机盐和生长因子发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂等,五、发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂,工业上常见的前体如表,五、发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂,促进剂：在酶制剂发酵过程中，加入促进剂，可以改进细胞的渗透性，同时增加氧的传递速度，改善菌体对氧的利用，增加产酶量。通常的促进剂有各种表面活性剂、二乙胺四乙酸、大豆油抽提物、黄血盐、甲醇等。,五、发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂,抑制剂：有些抑制剂可以抑制某些合成产物的途径而使代谢向所需要产物的途径转化，常被用于抗生素和有机溶剂发酵中，如甘露聚糖可以抑制甘露糖链霉素生产，只产生链霉素。,发酵工业原料的种类和成分,发酵培养基中各种成分的定量工业上常用作碳源的淀粉类原料工业上常用作氮源的蛋白质类原料发酵培养基中的无机盐和生长因子发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂等,发酵工业原料及其处理,第一节发酵工业原料的种类和成分第二节淀粉水解糖的制备第三节发酵培养基灭菌,第二节淀粉水解糖的制备,淀粉水解糖的制备方法淀粉酸水解制糖淀粉双酶法制糖水解糖液的质量要求,一、淀粉水解糖的制备方法,淀粉质原料因为大多数微生物不能直接利用或利用较少，所以必须水解为葡萄糖等可发酵糖类，才能被利用。淀粉糖化及淀粉水解糖淀粉水解的方法,1、淀粉糖化及淀粉水解糖,工业上将淀粉水解为葡萄糖的过程叫做淀粉的糖化。所制备的糖液叫做淀粉水解糖。淀粉水解糖包括多种糖类、少量氨基酸和脂肪酸等。淀粉水解糖被广泛用于各种发酵工业。淀粉水解糖的原料包括薯类、玉米淀粉、小麦淀粉和大米淀粉等。,2、淀粉水解的方法,根据水解采用的催化剂不同，可以分为三种方法酸水解酶水解酸酶结合水解,酸水解法,也叫做酸糖化法，以无机酸或有机酸为催化剂，高温高压下将淀粉水解为葡萄糖。优点：工艺简单、设备简易、生产周期短、设备生产能力大；缺点：设备耐高温高压、副反应多、原料要求严格、淀粉乳浓度不能过高。,酶水解法,第一步利用液化酶使糊化淀粉水解成糊精和低聚糖，粘度下降，流动性增加，叫做液化，第二步利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解成葡萄糖，称为糖化，也叫双酶水解法。优点：反应条件温和、设备耐压耐腐要求低、副反应小、转化率高、淀粉乳浓度无要求、可采用粗原料、营养物质丰富缺点：生产周期长、设备较多投资大、糖液过滤困难。,酸酶结合水解法,酸酶结合水解法是集酸法和酶法制糖的优点而成的生产工艺，分为酸酶水解法和酶酸水解法。酸酶水解：先以酸为催化剂将淀粉水解为糊精和低聚糖，然后用糖化酶水解为葡萄糖。酶酸水解：将淀粉乳先用淀粉酶液化到一定程度，用酸水解成葡萄糖。,淀粉水解糖的制备,淀粉水解糖的制备方法淀粉酸水解制糖淀粉双酶法制糖水解糖液的质量要求,二、淀粉酸水解制糖,（一）淀粉酸水解的理论基础（二）淀粉酸水解的工艺过程,（一）淀粉酸水解的理论基础,淀粉的水解反应淀粉酸水解反应动力学葡萄糖的复合反应分解反应,1、淀粉的水解反应,淀粉高温加酸作用下，首先颗粒结晶结构被破坏，然后作用于两个糖苷键，使之断裂，随着糖苷键的断裂，相对分子质量逐渐变小。H+参与了水解过程，将淀粉降解。H+对淀粉的糖苷键作用不是固定，故糖苷键断裂也没有规律，所以同时有糊精、低聚糖、麦芽糖和葡萄糖生成。,1、淀粉的水解反应,糊精是多种分子大于低聚糖的含有不同数量的脱水葡萄糖单位的糖的总称，可以根据与碘产生的颜色不同，判断水解程度，如蓝色、紫色、红褐色、红色、浅红色和无色等。,（一）淀粉酸水解的理论基础,淀粉的水解反应淀粉酸水解反应动力学葡萄糖的复合反应分解反应,2、淀粉酸水解反应动力学,淀粉水解实际是淀粉分子与水分子之间的双分子反应，但是反应进行的速度一般取决于淀粉的浓度，属于单分子反应的一级化学反应类型，酸浓度不变，属于催化剂。水解反应速率常数k是决定速度的关键，k值越高，糖化速度越快。K=cA,2、淀粉酸水解反应动力学,K=cA为催化剂的活性常数，其中盐酸最大，为1；c为酸体积摩尔浓度；是多糖的水解常数，可以衡量多糖之间水解难易程度；为温度对水解速度影响的常数。,（一）淀粉酸水解的理论基础,淀粉的水解反应淀粉酸水解反应动力学葡萄糖的复合反应分解反应,3、葡萄糖的复合反应,在淀粉糖化水解的过程中，生成的一部分葡萄糖受酸和热的影响，能通过糖苷键聚合失去水分子，生成二糖和其他低聚糖，叫做复合反应。多数复合糖不能被生产菌利用，造成发酵糖酸转化率低，还会为提取产物造成麻烦。复合反应是可逆的，也可以经过酸水解转变成葡萄糖。复合反应的发生条件,复合反应发生条件,葡萄糖浓度：随浓度增加而增加；淀粉乳浓度：浓度越高，水解所得的葡萄糖浓度也高，致使复合反应进行强烈，糖化得到的葡萄糖纯度相应下降；酸度和酸种类：对复合反应的催化作用，盐酸最强，其次是硫酸、草酸，随着酸浓度增加，复合糖量也会增加。,（一）淀粉酸水解的理论基础,淀粉的水解反应淀粉酸水解反应动力学葡萄糖的复合反应分解反应,4、分解反应,淀粉水解过程中，一部分葡萄糖会分解，继而产生乙酰丙酸和甲酸等，相互聚合之后可以产生色素。虽然分解反应损伤的葡萄糖并不多，但是色素产生会影响糖液质量。分解反应的影响因素有：糖化加热时间、酸度和葡萄糖浓度。,（一）淀粉酸水解的理论基础,淀粉的水解反应淀粉酸水解反应动力学葡萄糖的复合反应分解反应,二、淀粉酸水解制糖,（一）淀粉酸水解的理论基础（二）淀粉酸水解的工艺过程,（二）淀粉酸水解的工艺过程,淀粉酸水解法工艺流程淀粉酸水解法工艺条件确定糖化设备结构对质量影响水解糖液的中和与脱色除杂,1、淀粉酸水解法工艺流程,淀粉水解糖不需要提纯葡萄糖，质量只要能满足发酵要求即可。,淀粉,水,盐酸,调浆,糖化,蒸汽,冷却,中和脱色,碳酸钠,活性炭,压滤,滤渣,糖液,（二）淀粉酸水解的工艺过程,淀粉酸水解法工艺流程淀粉酸水解法工艺条件确定糖化设备结构对质量影响水解糖液的中和与脱色除杂,2、淀粉酸水解法工艺条件确定,选择工艺条件尽量减少复合与分解反应，提高原料利用率，提高糖液质量。淀粉原料选择无机酸选择与用量水解温度与压力淀粉乳浓度糖化终点,淀粉原料选择,尽量减少杂质含量，选择纯度较高的淀粉。杂质的危害：蛋白质可降解生成氨基糖，引起细菌细胞收缩，还可能引起发酵泡沫过多，脂肪灰分等可以降低酸的效能。糖化工艺根据实际淀粉的特点进行相应的改进。,无机酸选择与用量,目前国内普遍采用盐酸作为无机酸，但是复合反应相应也大，而且增加了糖液的盐分。国内还有采用硫酸作为无机酸，但是也无法完全去掉不利影响。日本多采用草酸作为催化剂，虽然酸度低，但是后续处理较易，不过效率稍低，不够经济。,水解温度和压力,淀粉水解是用蒸汽直接加热完成，工业上用压力控制条件。温度与糖化过程成正比，但是也与复合反应和分解反应成正比。经验数据为蒸汽压力在0.28-0.32MPa。,淀粉乳浓度,淀粉乳浓度主要需要考虑的是发酵的需求。乳浓度高，糖化后的葡萄糖浓度高，但是副产物相对较多；乳浓度低，糖液质量高，但是难以保证发酵，降低生产效率。,糖化终点,糖化的时间过短时水解不完全，葡萄糖含量低，糖液质量差；糖化时间过长则导致复合与分解反应增多，复合糖含量提高，色素增加。,（二）淀粉酸水解的工艺过程,淀粉酸水解法工艺流程淀粉酸水解法工艺条件确定糖化设备结构对质量影响水解糖液的中和与脱色除杂,3、糖化设备结构对质量影响,糖化锅结构对糖液质量有影响。容积过大，延长进料时间，水解时间差别大，易发生副反应；锅体太高，造成内部上下水解速率相差过大，放料无法保证；锅体太矮，必须增大直径，会出现死角区，使糖化不均匀。,（二）淀粉酸水解的工艺过程,淀粉酸水解法工艺流程淀粉酸水解法工艺条件确定糖化设备结构对质量影响水解糖液的中和与脱色除杂,4、水解糖液的中和与脱色除杂,中和：酸水解糖液必须中和除酸后才能使用，同时糖液中蛋白质等杂质呈胶体状，可调节酸碱度使蛋白质沉淀。中和操作温度不能过高，否则会产生焦糖，一般60-70；中和可用纯碱和烧碱，各有优缺点，必须配成一定浓度的碱水缓慢中和。,4、水解糖液的中和与脱色除杂,脱色除杂：有活性炭吸附法、离子交换法和新型磺化煤脱色法。活性炭表面积大，分为颗粒炭和粉炭，各有优缺点，使用温度65；离子交换法具有选择性强，脱色效果好，易于操作的特点，但是价格昂贵；新型磺化煤粒度细、脱色能力强，但是可能会堵塞容器管道。,4、水解糖液的中和与脱色除杂,压滤：压滤操作温度不宜过高，一般60-70为宜，保证糖液粘度和蛋白质的沉淀度合适，可达到较好效果。,二、淀粉酸水解制糖,（一）淀粉酸水解的理论基础（二）淀粉酸水解的工艺过程,淀粉水解糖的制备,淀粉水解糖的制备方法淀粉酸水解制糖淀粉双酶法制糖水解糖液的质量要求,三、淀粉双酶法制糖,双酶法是目前较理想的淀粉水解糖化方法，反应条件温和、副反应较少、糖液质量高。淀粉酶及其水解作用淀粉的液化及液化终点的控制淀粉糖化及糖化终点的控制,双酶法的两个步骤,酶水解位置水解次序水解产物液化淀粉酶1，4糖苷键无先后次序葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖异麦芽糖、低聚糖糖化糖化酶1，4和1，6从非还原性葡萄糖糖苷键末端开始,1、淀粉酶及其水解作用,-淀粉酶：能使水溶液中的淀粉分子迅速液化，产生较小分子的糊精，也叫做液化酶或糊精化酶。内切-1，4糖苷键，速度很快；水解速度受底物分子大小和结构影响，分子量越小越不易水解；不同来源的酶热稳性和最适温度不同；高浓度底物和钙离子对酶的耐热性有很大帮助。,1、淀粉酶及其水解作用,淀粉葡萄糖苷酶：也叫做糖化型淀粉酶、糖化酶，是外切型淀粉酶。从底物非还原性末端依次切下-葡萄糖；可以水解麦芽糖和支链淀粉；两种糖苷键都可以降解；也受到底物相对分子质量影响。,三、淀粉双酶法制糖,双酶法是目前较理想的淀粉水解糖化方法，反应条件温和、副反应较少、糖液质量高。淀粉酶及其水解作用淀粉的液化及液化终点的控制淀粉糖化及糖化终点的控制,2、淀粉的液化及液化终点的控制,液化理论液化程度的控制液化工艺,、液化理论,淀粉的糊化淀粉的老化淀粉液化的温度淀粉液化的方法与选择,、淀粉的糊化,糊化：淀粉颗粒由于受热吸水膨胀，晶体结构消失，形成复杂的网状结构，变成糊状液体，这种现象叫做糊化。发生糊化现象的温度为糊化温度。糊化的目的是-淀粉酶能够进入淀粉内部，淀粉酶水解淀粉颗粒和糊化淀粉的比例为1：20000。糊化过程分为三步：预糊化、糊化、溶解。,、淀粉的老化,老化：淀粉老化就是分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，即复结晶过程。淀粉酶无法液化老化的淀粉，更无法糖化。淀粉老化的影响因素有6种。,、淀粉液化的温度,淀粉液化时最好采用相对高一些的温度，原因如下：淀粉彻底液化需要高温下才能完成；高温可以提高酶活力：减少不溶性微粒的产生；克服淀粉老化；蛋白质絮凝较好；阻止小分子前体物质的生成，有利于葡萄糖收率。,、淀粉液化的方法与选择,酶液化淀粉的方法有：间歇液化法、半连续液化法、喷射液化法，各方法根据加酶方式不同、酶制剂耐温性不同可以细分。液化的三种方法通常应采用先进的液化工艺，国内一般采用喷射液化法进行液化，根据淀粉原料的不同采用不同的加酶方法。,间歇液化法,操作过程：间歇液化一般是在罐内进行，可将原料调浆后一次性打入罐内，然后启动搅拌，直接通入蒸汽，迅速将料液加热到预定温度进行液化，直至用碘液检验合格后立即升温灭酶然后送去糖化，这就是间歇液化，或称直接升温法。间歇液化的具体操作中，一些工厂的作法是先在罐内放入一定量的水，称为底水，然后通入蒸汽将底水加热到预定温度，并在此温度下一边进料一边进汽，直至进料完毕，保温液化。,半连续液化法,操作方法：相对于间歇液化法来说，如果料液在加热到预定温度后开始送入另一罐内继续保温液化直至液化完成，同时在原液化罐内连续进料进汽，保持预定的液化温度，那么这种边进料进汽、边出料继续液化至液化完成的形式就称为半连续式液化，或称喷淋式连续液化。,喷射液化法,操作方法：也叫做连续液化法，采用的设备是喷射器，料液与蒸汽的接触、混合是在喷射器内瞬间完成的，并通过在高温下短时间的停留达到彻底糊化的目的。这种操作得到的液体非常利于彻底液化淀粉。喷射的方法可以选择两种，即“汽带料”或者“料带汽”。,另外还有一种连续液化法叫做连消器连续液化，应用也较广泛。,2、淀粉的液化及液化终点的控制,液化理论液化程度的控制液化工艺,、液化程度的控制,液化目的：为糖化酶作用提供条件。液化程度：碘试本色的前提下，液化液DE值越低越好。检测方法：碘液试色，棕红色或橙黄色即可。液化程度太低会导致底物分子很少，影响糖化速度，而且淀粉易老化。液化程度太高则影响糖化酶与底物的结合，最终DE偏低。可用加热灭酶活性的方法控制液化程度。,2、淀粉的液化及液化终点的控制,液化理论液化程度的控制液化工艺,、液化工艺-一次加酶,一次加酶喷射液化工艺（DDS公司）,淀粉+水+酶,蒸汽,蒸汽,配料罐,喷射液化器,110,工艺控制：浓度30%pH6.5酶量0.1%喷射温度110，真空闪冷到95层流罐维持1-2h,两次加酶喷射液化工艺（DDS公司）,酶,淀粉+水+酶,蒸汽,蒸汽,蒸汽,蒸汽,配料罐,喷射液化器,保温罐,95-97,145,二次液化罐,、液化工艺-二次加酶,二次喷射的工艺过程,在配料罐内，将淀粉加水调浆成淀粉乳，用Na2CO3调pH，使pH值处在5.0-7.0之间，加入0.15%的氯化钙作为淀粉酶的保护剂和激活剂，最后加入耐高温-淀粉酶，料液经搅拌均匀后用泵打入喷射液化器，在喷射器中出来的料液和高温蒸汽直接接触，料液在很短时间内升温至95-97，此后料液进入保温罐保温60min，温度维持在95-97，然后进行二次喷射，在第二只喷射器内料液和蒸汽直接接触，使温度迅速升至145以上，并在维持罐内维持该温度3-5min左右，彻底杀死耐高温-淀粉酶，然后料液经真空闪急冷却系统进入二次液化罐，将温度降低到95-97，在二次液化罐内加入耐高温-淀粉酶，液化约30min，用碘呈色试验合格后，结束液化。,三、淀粉双酶法制糖,双酶法是目前较理想的淀粉水解糖化方法，反应条件温和、副反应较少、糖液质量高。淀粉酶及其水解作用淀粉的液化及液化终点的控制淀粉糖化及糖化终点的控制,3、淀粉糖化及糖化终点的控制,糖化理论糖化终点的控制糖化工艺,、糖化理论,糖化温度和pH：由所用的糖化酶的性质决定，尽量保证较高温度和较低pH。加酶量：可以适当提高酶量，但是过量则副反应增多，DE值下降，过滤难度增大。液化液DE值影响：在碘试反应基础上，DE值越低则糖化效果越好。异淀粉酶的影响：糖化酶对-1,6糖苷键的水解速度慢，故可以添加异淀粉酶一起提高效率。,、糖化终点控制,终点检测：用无水乙醇滴入糖化液中，无白色沉淀即说明达到终点。糖化不完全导致DE值不够，糖化过度则会引起过量的副产物。糖化结束后必须高温灭酶。,、糖化工艺,糖化是在一定浓度的液化液中，调整适当温度与PH值，加入需要量的糖化酶制剂，保持一定时间，使溶液达到最高的葡萄糖值。工艺流程较简单。,双酶法制糖工艺流程图,17,5,3,蒸汽,淀粉碱液氯化钙-淀粉酶,糖化酶,水,回流,1,4,6,5,6,11,7,10,89,12,13,14,15,16,18,1-调浆配料槽2，8-过滤器3，9，14，17-泵4，10-喷射加热器5-缓冲器6-液化层流罐,7-液化液贮罐11-灭酶罐12-板式换热器13-糖化罐15-压滤机16-糖化暂贮槽18-贮糖槽,2,三、淀粉双酶法制糖,双酶法是目前较理想的淀粉水解糖化方法，反应条件温和、副反应较少、糖液质量高。淀粉酶及其水解作用淀粉的液化及液化终点的控制淀粉糖化及糖化终点的控制,淀粉水解糖的制备,淀粉水解糖的制备方法淀粉酸水解制糖淀粉双酶法制糖水解糖液的质量要求,四、水解糖液的质量要求,淀粉水解糖液的质量要求如下：色泽：淡黄色透明；糊精反应：无；还原糖含量：18%（酸水解），25-38%（双酶水解）；DE值：90%，95%；透光率：40%，60%（特定条件下）pH：4.6-4.8淀粉转化率：92%（酸，玉米淀粉），95%（双酶，玉米淀粉），87%（酸，大米糖）,发酵工业原料及其处理,第一节发酵工业原料的种类和成分第二节淀粉水解糖的制备第三节发酵培养基灭菌,第三节发酵培养基灭菌,消毒与灭菌的原理和方法培养基和设备灭菌发酵培养基灭菌工艺培养基和设备、管路灭菌的条件,二、培养基和设备灭菌,发酵工业上湿热灭菌法应用最普遍，灭菌效果最好。工业灭菌尽量要求杀死微生物，但是尽量少破坏培养基的成分。（一）培养基湿热灭菌原理（二）灭菌温度与时间的计算和选择（三）影响培养基灭菌效果的因素,（一）培养基湿热灭菌原理,微生物的热阻微生物的热死定律反应速率常数,1、微生物的热阻,几个概念：致死温度：杀死微生物的极限温度；致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所用时间；热阻：微生物在某一特定条件下的致死时间。致死温度和致死时间是衡量热灭菌的指标。,e.g伤寒杆菌5830min变形杆菌5560min,数学表达式：,-dN/dt=kN,N培养基中活的微生物个数；t时间（s）;k比死亡速率（s-1）(死亡速率常数)dN/dt微生物的瞬间变化率，即死亡速率,对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。,2、微生物的热死定律,若开始灭菌（t=0）时，培养基中活的微生物数为N0,-dN/dt=kN,lnN/N0=-kt,2.303logN0/N=kt,or,2、微生物的热死定律,可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数N）和k值,在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据。,灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即N=0，则t为，上式无意义，事实上也不可能。一般取N=0.001，即1000次灭菌中有1次失败。,2、微生物的热死定律,例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每ml有2105个耐热细菌芽孢，121时灭菌速度常数为1.8min1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。,3、反应速率常数,反应速率常数k是微生物耐热性的一种特征，随微生物种类和灭菌温度有差异。反应速率常数k与温度的关系，可用阿累尼乌斯方程表示。一般情况下，提高灭菌温度，k值增大，灭菌时间显著缩短。,（二）灭菌温度与时间的计算和选择,杀灭细菌芽孢的温度和时间培养基灭菌温度的选择,1、杀灭细菌芽孢的温度和时间,杀灭细菌芽孢的温度和时间是根据具体试验确定。综合来讲，大都数细菌芽孢的致死温度和致死时间范围是在121，20-30min。,2、培养基灭菌温度的选择,培养基营养成分的分解也符合一级分解反应动力学。直观理解，即温度的提高可以加速营养成分的降解。其他条件不变时，也可以用阿累尼乌斯方程表示。,-dC/dt=kC,2、培养基灭菌温度的选择,微生物死亡的速率随温度升高增加的倍数大于培养基成分破坏随温度升高增加的倍数，因此可以选择适当的温度和时间。采用高温短时杀菌效果较好。,（三）影响培养基灭菌效果的因素,影响培养基灭菌效果的因素除灭菌温度和时间之外，还有其他几个，分别是培养基的成分、培养基物理状态、pH值、微生物数量、微生物细胞含水量、微生物细胞菌龄、微生物细胞耐热性、蒸汽中空气排除情况、搅拌和泡沫等。,培养基成分和物理状态,培养基成分：脂肪、糖分和蛋白质含量越高，微生物热死亡速率越慢，如果有盐分色素存在则较易灭菌。培养基物理状态：固体培养基比液体培养基灭菌时间要长，如果有大颗粒和粗纤维，则应先过滤后灭菌。,培养基pH,培养基pH越低，需要的灭菌时间就越短。,温度孢子数灭菌时间(min)()(个/ml)pH=6.15.35.04.74.5120100008753311510000252516131311010000706535302410010000740720180150150,培养基中微生物因素,微生物数量：数量越多，灭菌时间越长；微生物细胞含水量：含水量越多，越容易受到温度影响而死亡；微生物细胞的菌龄：年老细胞要比年轻细胞具有更强的抵抗能力；微生物的耐热性：不同微生物细胞耐热性有差异，细菌营养体、酵母、霉菌菌丝体对热敏感，放线菌、霉菌孢子等则较耐热。,空气、搅拌和泡沫,空气：灭菌温度控制是利用水蒸气的压力来控制的，如空气过多，则水蒸气的压力不准，温度则不准确；搅拌：充分搅动可以排除局部死角造成的灭菌不彻底；泡沫：培养基产生的泡沫对灭菌极为不利，要尽量减少。,发酵培养基灭菌,消毒与灭菌的原理和方法培养基和设备灭菌发酵培养基灭菌工艺培养基和设备、管路灭菌的条件,三、发酵培养基灭菌工艺,间歇灭菌连续灭菌间歇灭菌与连续灭菌的比较,、间歇灭菌,间歇灭菌的温度变化间歇灭菌的计算间歇灭菌的工艺操作,间歇灭菌的温度变化,间歇灭菌也叫做分批灭菌或实罐灭菌，即将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起加热灭菌的过程。,间歇灭菌的计算,不计升温过程杀菌的效果，把培养基所有的菌都当做保温阶段杀死，这样可以粗略计算灭菌所需时间。实际计算时，100以上的时间都是有灭菌效果的。,V=V加热+V维持+V冷却,RT2(E2RT)V加热=t加热(T-T0)E2,RT2(E2RT)V冷却=t冷却(T-T0)E2,R：气体常数；=1.986卡/克分子KE：耐热孢子致死的活化能；=65000卡/克分子T：灭菌维持温度；121（393K）T0：开始计算灭菌效果的温度；100（373K）,例1：小型发酵罐在120灭菌维持15分钟，由100（100以下灭菌效果不计）加热至120的时间为5分钟，由120冷却到100的时间为3分钟，计算总的灭菌时间。,1.9863932(6500021.986393)V加热=5=1.15(393-373)650002,1.9863932(6500021.986393)V冷却=3=0.69(393-373)650002,V=V加热+V维持+V冷却=1.15+15+0.69=16.6(min),例）如果灭菌条件不变，大罐由加热到需分钟；冷却至的时间为分钟；求大罐的维持时间。,1.9863932(650001.986393)V加热V冷却=（）(393-373)650002.min,则大罐维持时间V维持=V（V加热V冷却）16.69.2=7.4min,在不同规模的发酵罐中达到同样灭菌效果所需时间,发酵罐规模（升）维持时间（分）20017.550012.6500011.3500008.8,间歇灭菌的工艺操作,灭菌之前，发酵罐的空气分过滤器要进行灭菌、吹干，若已空罐灭菌，则可以省略；预热：向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70左右。作用是利于糊化、减少冷凝水的生成、减轻噪音；开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。罐压达1kg/cm2(0.1MPa)时，安装在发酵罐封头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。,间歇灭菌的工艺操作,保温调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度保持在一稳定水平，维持一定时间。保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内压力降至0.5kg/cm2左右时，向罐内通入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温度。,三、发酵培养基灭菌工艺,间歇灭菌连续灭菌间歇灭菌与连续灭菌的比较,、连续灭菌,连续灭菌的温度变化连续灭菌的计算连续灭菌的工艺流程,连续灭菌的温度变化,连续灭菌，就是将配制好的培养基在向发酵罐等培养基装置运送的同时，进行加热、保温和冷却而进行灭菌。,连续灭菌的计算,例：（p84）解：C0=2105（个/ml）;Ct=1/40106103=2.510-11（个/ml）则灭菌时间t=2.37min,连续灭菌的工艺流程,1配料罐3连消装置4维持罐6冷却装置,配料罐（兼作预热）,输料泵,连消塔（器）,维持罐（管）,冷却器,发酵罐,预热,可用专门的预热罐，也可用配料罐兼作,温度：一般预热至70左右,预热的物料用泵泵入连消装置,输料泵：常用旋涡泵、往复泵、螺杆泵,旋涡泵,往复泵,螺杆泵,加热,常用连消装