经典液相色谱法

第九章经典液相色谱法,经典液相柱色谱法,液相色谱的固定相和流动相,液相色谱法类型,平面色谱法,薄层扫描法简介,本章要求,掌握,熟悉,了解,液相色谱技术的基本原理,吸附等温线,液相色谱技术的基本操作,3,液相色谱法类型,LC以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法,LiquidChromatography,定义,4,-按分离效能,分类,经典液相,现代液相,-按操作形式,-按分离机制,液相色谱法类型,5,常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法,经典液相色谱法,经典柱色谱法,平面色谱法,现代液相色谱法,高压输液泵输送流动相,高效液相色谱法（HPLC）,液相色谱法类型,6,液相色谱的固定相和流动相,吸附色谱分配色谱离子交换色谱空间排阻色谱,7,吸附色谱,固定相吸附剂流动相有机溶剂,溶质基于吸附现象而获得分离的液-固色谱分析方法分离分析极性至弱极性的化合物,液相色谱的固定相和流动相,8,1.对吸附剂的要求1）有较大表面积和足够的吸附能力，对不同物质吸附能力不同2）与洗脱剂、溶剂、样品不起化学反应，且不溶于洗脱剂和溶剂3）粒度细而均匀,吸附色谱的固定相,液相色谱的固定相和流动相,9,2.常用吸附剂-有机类：活性炭、淀粉、蔗糖等、聚酰胺、大孔树脂-无机类：氧化铝、硅胶、硫酸钙、滑石粉、硅藻土等,液相色谱的固定相和流动相,10,液相色谱的固定相和流动相,11,1）硅胶（SiO2xH2O)吸附能力：取决于骨架表面硅羟基-极性吸附剂吸附机理：氢键作用-硅羟基为质子给予体,适用范围：适用于分离酸性和中性化合物活化温度：105110,物质的极性越大，硅胶吸附能力越强溶剂的极性越弱，硅胶吸附能力越强,化学反应将有机分子以共价键连接在硅羟基上，则成为化学键合固定相，按键合官能团极性分为极性键合相及非极性键合相,液相色谱的固定相和流动相,12,2）氧化铝优点：分离能力强、活性可控分类：酸性、中性、碱性，以中性氧化铝使用较多用途：酸性-分离酸性化合物，如有机酸中性-分离生物碱、挥发油、萜类、甾体、蒽醌以及在酸碱中不稳定的苷类、醌、内酯碱性-分离碱性和中性化合物，如生物碱类活化温度：200400,活化：一定温度下加热除去水分以增强活性的过程失活：一定温度下加入一定量水分使吸附剂活性降低的过程,液相色谱的固定相和流动相,含水量越低，活度级别越小，吸附能力越强。含水量越高，活度级别越大，吸附能力越弱。,吸附剂的吸附能力常称为活度或活性,液相色谱的固定相和流动相,14,3）聚酰胺常用种类：聚己内酰胺作用机理：氢键作用（1）酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中的羟基或羧基形成氢键（2）酰胺基中的氨基与醌类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键,液相色谱的固定相和流动相,15,4）大孔吸附树脂定义：不含交换基团，有大孔网状结构的高分子吸附剂种类：非极性和中等极性两类范围：水溶性化合物的分离纯化,液相色谱的固定相和流动相,16,组分在色谱柱中的移动速度和分离效果取决于：1.吸附剂对样品各组分的吸附能力-吸附活性2.洗脱剂对各组分的解吸能力-极性大小3.待分离各组分本身极性差异-结构性质,吸附色谱的条件选择,液相色谱的固定相和流动相,17,1.化合物的极性及其判断规律,常见化合物按其极性由小到大顺序为：烷烃烯烃醚硝基化合物二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺类醇类酚类羧酸类,依据规律：（1）基本母核相同基团极性越强，整个分子极性越强（2）分子中双键越多，吸附能力越强共轭双键越多，吸附能力也越强（3）基团的空间排列能形成分子内氢键吸附能力较弱,液相色谱的固定相和流动相,18,分离极性小的物质，选用吸附能力强的吸附剂分离极性大的物质，选用吸附能力弱的吸附剂,2.吸附剂的选择,液相色谱的固定相和流动相,19,常用溶剂的极性顺序为：石油醚环己烷四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷乙醚氯仿乙酸乙酯丙酮正丁醇乙醇甲醇水乙酸,3.流动相的选择,分离极性大的物质应选用极性大的溶剂分离极性小的物质应选用极性弱的溶剂,液相色谱的固定相和流动相,20,选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物质、流动相三方面综合考虑。,吸附色谱三要素之关系,液相色谱的固定相和流动相,21,分配色谱,正相分配色谱：固定相的极性大于流动相反相分配色谱：固定相的极性小于流动相,液相色谱的固定相和流动相,22,分配色谱的固定相,固定相：载体+固定液某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成液膜,正相分配色谱法：水、各种缓冲剂、稀硫酸、甲醇、甲酰胺、丙二醇等强极性溶剂及它们的混合液等反相分配色谱法：硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶剂,1.固定液,液相色谱的固定相和流动相,23,2.常用的载体（只起负载固定相的作用）,（1）硅胶：吸收本身重量50%以上水分后丧失吸附作用（2）硅藻土：应用最多的载体-硅藻土中氧化硅性质较为致密，几乎不发生吸附作用（3）纤维素：纸色谱的载体，也是分配柱色谱常用载体,3.对载体的要求化学惰性对固定液有较强吸附性，但对组分无吸附性颗粒大小均匀，纯净,液相色谱的固定相和流动相,24,4.流动相,正相色谱：石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷类、苯或混合物反相色谱：水、各种水溶液（包括酸、碱、盐及缓冲液）、低级醇类,要求：与固定液不互溶，极性相差较大对样品组分的溶解度足够大，又相对小于固定液对组分的溶解度,液相色谱的固定相和流动相,分配色谱的条件选择,先使用对各组分溶解度大的溶剂为洗脱剂再根据实际分离情况改变洗脱剂的组成即：在流动相中加入一些可调节溶解度的溶剂，以改变各组分待分离的情况与洗脱速率,液相色谱的固定相和流动相,26,离子交换剂为固定相水或与水混合的溶剂为流动相根据离子交换剂对各组分离子亲合力不同使其分离,离子交换色谱,(ionexchangechromatography),液相色谱的固定相和流动相,27,离子交换树脂包括基体离子和可交换离子分类：阳离子交换树脂-含-SO3H、-COOH阴离子交换树脂-含-NH2、NHR规律：组分离子对基体离子的亲合力越大，即交换能力越强，就越易交换到离子交换剂上，保留时间就越长,离子交换色谱的固定相,液相色谱的固定相和流动相,28,空间排阻色谱法,定义：利用某些凝胶对不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离的方法实质：分子筛效应固定相：化学惰性多孔物质凝胶分类：根据流动相的不同以有机溶剂为流动相，称为凝胶渗透色谱法以水溶液为流动相，称为凝胶过滤色谱法,液相色谱的固定相和流动相,29,固定相的类型,葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶,亲水性凝胶,亲脂性凝胶,液相色谱的固定相和流动相,硅胶吸附柱色谱,聚酰胺柱色谱法,离子交换柱色谱法,凝胶柱色谱法,经典液相柱色谱法,31,平面色谱法,借用毛细作用的原理输送展开剂（流动相），色谱过程在平面上进行的方法。固定相成平面状态，试样溶液点于平面一端，在相对密闭的容器中展开（分离）后，根据组分在平面上移动的距离和浓度进行分析。常用有薄层色谱法和纸色谱法,32,1）比移值Rf2）相对比移值(Rst)3）分离度（Rs）,平面色谱法的定性参数,平面色谱法,33,比移值Rf,在薄层色谱法中，用比移值Rf表示各组分在色谱中的保留行为,Rf表示物质色谱特性的参数，可用以定性分析,平面色谱法,34,在给定条件下，Rf值为常数，其值在01之间Rf=0表示化合物在薄层上不随溶剂扩散移动，仍在原点位置Rf=1表示溶质不进入固定相，即表示溶质和溶剂同步移动一般要求Rf值0.20.8之间，最佳范围0.30.5,平面色谱法,35,影响Rf值的因素：分离对象的化学结构固定相的组成及性质流动相的组成及性质介质的影响（包括实验室及展开箱的湿度、温度、饱和与否、上样量等等）,平面色谱法,36,解决方法：由于Rf值重现性差，进行定性困难的问题，可以采用相对比移植Rst来定性。,平面色谱法,37,参照物-另外加入的某一物质的纯品-试样混合物中的某一组分RfVS.Rst-取值范围不同:Rf值小于1，Rst值不一定小于1,相对比移值(Rst),试样中某组分的移动距离与参照物移动距离之比,平面色谱法,38,l2、l1-原点至两斑点中心的距离d-两斑点中心间的距离W1、W2-两斑点的宽度,分离度(Rs),两相邻斑点中心间距离与两斑点平均宽度（直径）的比值,现行版中国药典规定薄层色谱法中：Rs1,平面色谱法,39,固定相-均匀涂铺在具有光洁表面的玻璃、铝箔、塑料片或金属板上形成薄层流动相-展开剂分离过程-混合试样溶液置于薄层板一端确定位置（点样），在相对密闭容器中用适当的展开剂展开，通过物理或物理化学的方法观察组分斑点的移动距离，根据Rf或Rst及斑点大小进行定性定量分析的方法,薄层色谱法thinlayerchromatography，TLC,平面色谱法,1）常用吸附剂硅胶200300目硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254氧化铝碱性氧化铝、酸性氧化铝和中性氧化铝氧化铝H、氧化铝G和氧化铝HF254,平面色谱法,2）展开剂及其选择一般原则：与吸附柱色谱法中选择流动相的原则相同主要根据：-被分离物质的极性-吸附剂的活性-展开剂本身的极性,点滴实验法,平面色谱法,42,规律：酸性组分-加入一定比例的酸，可防止斑点拖尾碱性物质-氧化铝为吸附剂，中性溶剂为展开剂硅胶为吸附剂，碱性展开剂；碱性较弱的生物碱可使用中性展开剂,平面色谱法,43,3）操作技术,选择制板点样展开检视分析,平面色谱法,44,选择(1)选板：玻璃板、塑料膜、金属铝箔表面光滑、平整清洁(2)固定相（吸附剂）粘合剂：CMC-Na、煅石膏、淀粉等(3)流动相（展开剂）(4)显色剂,平面色谱法,45,制板将吸附剂均匀地涂铺在玻璃板上使成薄层步骤：(1)吸附剂的涂布(2)板的活化,平面色谱法,46,(1)吸附剂的涂布硬板(加粘合剂)硅胶软板(不加粘合剂)氧化铝硬板的涂铺方法：倾注法、平铺法、涂铺器、喷雾法,平面色谱法,47,(2)板的活化铺成的薄层，置于水平台面上晾干（也可以热风吹干）置烘箱中于105110活化0.51小时,平面色谱法,48,点样一般使用微量注射器或毛细管点样,平面色谱法,49,注意事项：溶剂、点样量和正确的点样方法（1）溶剂应易挥发，不要以水为溶剂改变吸附剂活度（2）样品浓度不能过高产生拖尾浓度也不能过低起始点为空心点，色谱斑点畸形对照品浓度控制在几mg/mL（3）点样体积宜在20l以下、直径3mm，需分次点加（4）点加量一般为几几十mg过多斑点太大，形状不良太少斑点模糊或无法显色（5）原点距离底边、两侧边及点与点之间的距离大于1cm（6）点样管用内径约0.51mm的毛细管，管口应平整（7）点样操作需迅速暴露空气中时间过长吸水降低活性,平面色谱法,50,展开（1）展开原理（2）展开装置（3）展开方式（4）展开剂的选择（5）边缘效应,平面色谱法,51,（1）展开原理将薄板一端浸入展开剂，点样处不可接触展开剂，展开剂借助毛细作用上升，带动样品中组分的迁移。,平面色谱法,52,（2）展开装置,立式,卧式,平面色谱法,53,（3）展开方式,软板只能进行近水平展开硬板可以进行近水平、下行、上行、径向、双向、多次展开，其中以上行法展开最为常用,平面色谱法,54,（4）展开剂的选择首选单元溶剂，再选混合溶剂（由简至繁）若二元溶剂系统不够理想可考虑多元溶剂系统,平面色谱法,55,（5）边缘效应定义：同一组分的色谱斑点在同一薄层板上出现在边缘部分的Rf与中间部分的Rf有差异的现象产生原因：色谱缸内溶剂蒸气未达饱和，造成展开剂的蒸发速率在薄层板两边与中间部分不等边缘部分的Rf相对较大,平面色谱法,56,减少边缘效应的办法：用较小体积的展开缸或将薄层在缸内放置一定时间待溶剂蒸汽达到饱和后再展开在展开缸内壁贴上浸湿展开剂的滤纸条采用3cm以下的狭小薄板，只点23个点,平面色谱法,57,检视（1）物理检出法（光学）（2）化学检出法（显色）,平面色谱法,检视方法,58,59,（1）用保留值定性Rf（2）用多种溶剂系统定性,分析,1）定性分析,（1）斑点捕集后洗脱测定法（2）薄层扫描法,2）定量分析,平面色谱法,60,展开时间短，十几到几十分钟；分离能力强，斑点集中；灵敏度高，用量几至几十微克；显色方便；仪器简单，操作方便。,薄层色谱法的特点,平面色谱法,61,在经典薄层色谱法基础上发展起来的更灵敏、精细的薄层技术吸附剂颗粒小而均匀，用喷雾法制备的薄层很均匀，分离效率比经典薄层色谱提高三倍。分离组分多，分析