医学分子生物学新技术应用ppt课件

.,1,分子生物学新技术及其应用,申志发E-mail：shenzhifaTel：15868772693662693（短号）温州医科大学检验医学院/生命科学院教育部检验医学重点实验室,.,2,代谢组学及研究技术microRNA的研究及应用免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation）4.胞内RNA分子可视技术,.,3,第一节代谢组学及其研究进展,什么是代谢组学？代谢组学研究方法代谢组学分析技术气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）核磁共振技术（NMR）,.,4,代谢组学研究什么？,生物体系（细胞、组织或生物体）代谢产物发生变化（种类，随时间变化）,特定基因突变,环境变化,生物体系,代谢组学研究对象,.,5,体内各种物质代谢过程互相联系形成一个整体,各种物质代谢之间互有联系，相互依存。,.,6,.,7,机体物质代谢不断受到精细调节,机体有精细的调节机制，调节代谢的强度、方向和速度,内外环境的变化,对机体代谢造成影响,适应环境的变化,精细的调节控制,.,8,代谢组(metabolome)是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合,包含一系列不同化学型的分子,比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。代谢组学(metabonomicsmetabolomics)来源于代谢组一词,是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。,.,9,代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态,协助阐释新基因或未知功能基因的功能,并且可以揭示生物各代谢网络间的关联性,帮助人们更系统地认识生物体。进行代谢组学研究涉及生命科学、分析科学以及化学统计学三大方面的专业知识。代谢物化学分析技术及数据分析技术的发展极大促进了诸多生物、医学问题的研究,这些知识的综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极为重要的作用。,.,10,普遍定义,代谢组学：通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。研究对象：相对分子质量小于1000的内源性小分子。代谢物小分子类别：多肽、氨基酸及其衍生物、胺、脂类、金属离子。,.,11,特点,1.关注于内源性小分子化合物。2.对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究3.内源性小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。4.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。,.,12,代谢组学的发展,.,13,研究方法,研究步骤：,生物组织，体液经灭活预处理,多个方法联用,.,14,应用,药物研发疾病研究植物代谢组学微生物代谢组学中药现代化,.,15,连接图数据库ConnectionsMapDB京都基因与基因组百科全书KEGG(http:/www.genome.jp/kegg/ligand.html)生物化学途径ExPASy互联网主要代谢途径mainmetabolicpathwaysonInternert,MMPDuke博士植物化学和民族植物学数据库Arizona大学天然数据库Wiley_handbookofgc-ms新药及其代谢产物质谱库http:/www.ualberta.ca/_gjones/mslib.htm“肿瘤”代谢组数据库http:/www.metabolic-Pubmed化合物数据库NIST质谱数据库/srd/nistl.htm,一些有用的数据库：,.,16,代谢组学分析技术,气相色谱-质谱联用技术（GC-MS)液相色谱-质谱联用技术（LC-MS)毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS)核磁共振技术（NMR）,.,17,分析技术,1.气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）工作原理：,气相色谱仪,接口,质谱仪,常压,高真空,离子源,质量分析器,检测器,.,18,质谱仪的基本结构及工作流程,.,19,几种新的GC-MS技术,全二维气相色谱质谱技术（GCGC-TOFMS）,气化室,检测器,色谱柱1,色谱柱2,调制器,.,20,研究实例,用LecoChromaTOFsoftware得到的质荷比为73（m/z）的离子碎片典型GCGC-TOFMS二维血浆色谱图（AnalyticaChimicaActa，2009，633，257-262）,大连化物所许国旺教授分析确定5种糖尿病病源标记物：葡萄糖、2-羟基异丁酸、亚麻油酸、软脂酸、磷酸。脂肪酸代谢紊乱,.,21,GC-MS适用于挥发性的代谢物。对于非挥发性代谢物的分析需要经过化学衍生。多用于环境分析、大气有毒气体分析、某些疾病诊断等。,.,22,2.液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）LC工作原理：,.,23,液相色谱-质谱联用的新技术,4000QTrapLC/MS/MS,.,24,高效液相色谱系统配合液相质谱系统。健康和慢性乙肝病人的血清样本。,使用PLS-DA处理代谢数据正常组和慢性乙肝组对照（JournalofProteomeResearch,2006,5,554-561）,.,25,新型液相色谱技术UPLC,新型超高液相色谱仪,HPLC色谱柱填料颗粒：3、5m,UPLC色谱柱填料颗粒：1.7m分离能力得到空前提高,.,26,比较（a）HPLC和（b）UPLC用于美沙芬的代谢物TOP质谱全扫描（RapidCommunMassSpectrom,2005,19,843）,.,27,UPLC在代谢组学中的研究优势,UPLC相对于传统的HPLC有更好的分离效率、峰容量、及灵敏度，提供更适合与质谱联用的接口，有助于检出更多的代谢物。提高方法通量、灵敏度，改善与质谱联用的定性定量结果。UPLC与质谱联用为代谢组学研究提供更加高效、灵敏的研究平台。,.,28,毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）,代谢组学研究的生物样品中包含多种离子性代谢物（糖酵解代谢产物、三羧酸循环代谢物、如羧酸、磷酸化糖；以及核苷酸、氨基酸、辅酶等代谢物。）毛细管电泳是以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。适用于普通反相色谱柱不易保留的离子性代谢物的分离分析。,.,29,毛细管电泳-质谱联用分析仪（兰州理工大学）型号：P/ACEMDQ-DecaXPplus厂家：美国BeckanCoulter-Finnigan,.,30,（NMR）,基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学，主要用于反映化合物结构中的H和C原子的位置信息。1H-NMR：在排除杂质及水峰的干扰下，1H-NMR的谱峰与样品中的化合物的氢原子是一一对应的。所测的样品中的每一个氢在谱图中都有唯一的谱峰与之相对应。图谱中信号的强弱则反映出样品中各组分相对含量的关系，适用于研究代谢产物。,.,31,.,32,核磁共振,电子云：,基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学。主要用于反应化合物结构中的H和C原子的位置信息。,.,33,hr-MASofbiologicaltissue,相同强度,放大,人前列腺组织（prostatetissu）良性vs.恶性,癌症组织给出更多的脂类物含量（lipid）！,.,34,代谢组学研究一般包括四个步骤：第一步，给予生物体一定的刺激。第二步，代谢组数据的采集。用核磁共振、质谱、色谱等分析手段测定其中代谢物的种类、含量和状态以及其变化。,第三步，建立表征代谢特征的时空模型。在代谢组学中最常用的建模方法是主成分分析(PrincipleComponentsAnalysis,PCA)。第四步，建立代谢物时空变化与生物体特性的关系，达到从不同层次和水平上阐述生物体对相应刺激的响应的目的。,.,35,microRNA的研究与应用,.,36,10.1.1概述10.1.2.microRNA的分子生物学研究方法10.1.3microRNA的实验技术10.1.4microRNA与疾病,内容结构,.,37,概述,miRNA是由2125个核苷酸组成的非编码RNA；它通过与靶基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达；它在生物体生长发育、细胞增殖、分化、凋亡以及人类各种疾病的发生发展过程中发挥重要的调控作用。,?,什么是miRNA？,.,38,概述MicroRNA的发现,lin-4:Lee等人于1993年在线虫中通过胚胎发育时间控制缺陷性遗传筛选实验中发现，是第一个被发现的miRNA。lin-4在L1,L2阶段大量表达，如缺失，则导致幼虫发育停顿。,L1,L2,L3,L4,L1L4，线虫发育的四个不同阶段,.,39,let-7:Rinhart等人于2000年在线虫发现第二个miRNA，let-7。let-7在L3,L4阶段大量表达，控制幼虫的L4阶段向成虫阶段发育转换。,L1L4，线虫发育的四个不同阶段,概述MicroRNA的发现,.,40,MicroRNA的起源与生物合成过程,1.miRNA基因被转录成pri-miRNA(RNA聚合酶)；2.pri-miRNA被剪切成具有70-100个核苷酸的pre-miRNA(Drosha,DGCR8)；3.pre-miRNA从核内被转移至胞质(Exportin-5,Ran-GTP)；4.pre-miRNA被剪切成21-25个核苷酸的双链RNA双体(Dicer,TRBP,PACT)；5.双链RNA双体中成熟miRNA链会选择性整合入RISC,并与mRNA互补配对。,.,41,MicroRNA的起源与生物合成过程,.,42,miRNA与siRNA的性质比较,引自方福德,microRNA的研究方法与应用,中国协和医科大学出版社,2008,.,43,续表1,.,44,续表2,.,45,MicroRNA的鉴定,正向遗传学的突变筛查方法（最初几个miRNA分子的发现；效率不高）；cDNA克隆技术（有优势也有不足）；生物信息学预测方法（是实验预测方法有益和必要的补充；目前两个最主要的miRNA基因预测工具：MiRscan和miRseeker）当然计算机预测的miRNA必须经过RT-PCR或Northern试验分析才能鉴定,.,46,MicroRNA的特征,广泛存在于真核生物中,是一类内源性表达的非编码短序列RNA,本身不具有开放阅读框(ORF)；成熟的miRNA长度通常为2125nt；miRNA在进化上具有高度保守性；miRNA表达具有细胞和组织特异性，同时具有时序性如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达,.,47,MicroRNA的功能,miRNA通过基因的转录后调控过程参与了生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的各个过程。如线虫幼虫发育阶段的转换，哺乳动物的造血分化，脂类代谢，激素分泌，癌症，糖尿病，白血病以及病毒感染等。,.,48,部分已知功能的miRNA,引自方福德,microRNA的研究方法与应用,中国协和医科大学出版社,2008,.,49,续表,.,50,MicroRNA的调控机制,mRNA剪切miRNA与靶mRNA几乎完全互补；切割位点在从5端起与miRNA配对的第10位和11位核苷酸之间；由RISC中的内切酶催化完成；可催化多个mRNA分子的降解翻译抑制miRNA与靶mRNA互补程度较低；翻译抑制可能发生在翻译起始后的某一阶段；翻译顺利进行但翻译产物可能被特异性降解,每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达,.,51,MicroRNA表达的研究方法,miRNA基因芯片技术，高通量检测miRNA表达情况的最佳选择；PAGE/Northernblotting杂交法，可用于miRNA表达水平的定量检测，还能与RNAmarker结合使用检测miRNA分子的大小，用来排除其他小分子RNA的污染；原位杂交，可直观显示生物体miRNA的时间和组织特异性表达谱；miRNA实时定量PCR，可高度灵敏地检测出低丰度表达地靶分子，适用于高通量筛选。,.,52,miRNA功能研究的主要实验策略,引自JKrtzfeldt,MatthewNPoyandStoffel.StrategiestodeterminethebiologicalfunctionofmiRNAS.NatureGenetics,2006,38(suppl):S14-S19,.,53,MicroRNA功能研究方法,miRNA体外或体内水平的过表达研究构建相应的表达载体体外合成miRNA前体分子miRNA表达抑制研究基因水平抑制miRNA表达使用反义核酸分子抑制miRNA表达,.,54,.,55,miRNA基因克隆,（一）基本原理：miRNA克隆是依赖于其本身的特殊结构，5端的磷酸基团和3端的羟基基团，以T4RNA连接酶在分子末端加上连接子，然后利用RT-PCR方法扩增获得目的片段，克隆到合适的载体，最后测序验证。（二）应用：microRNA基因克隆主要用于寻找新microRNA基因，同时还可获得精确的表达信息。,.,56,MichaelMZ,2006,miRNA基因克隆策略,.,57,miRNA基因克隆的基本步骤,（一）总RNA的提取关键：尽量不使小RNA丢失（二）小分子RNA分离纯化及富集变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）方法是用于小分子RNA分离纯化的理想方法。（三）小分子RNA片段修饰小分子RNA的修饰包括磷酸化、去磷酸化以及在3端和5端连接上连接子等,.,58,miRNA基因克隆的基本步骤,（四）克隆及测序鉴定含3与5端接头的小分子RNA，经RT-PCR扩增后连接至合适的载体，转化克隆，最后用相关方法鉴定阳性克隆。（五）PAGE/Northernblotting验证PAGE/Northernblotting方法是确认microRNA最有效和常用的方法。,.,59,PAGE/Northernblotting,（一）基本原理：PAGE/Northernblotting与常规核酸杂交技术原理相同，都是根据碱基互补配对原理，设计特异探针，与膜杂交，经放射自显影后分析杂交信号。唯一的差别在于选择对小分子RNA分离效率更高的PAGE代替琼脂糖作为分离胶。（二）应用：PAGE/Northernblotting方法能提供准确的杂交信息以及有效检测低丰度的RNA分子，在验证micorRNA基因芯片结果及降低假阳性方面具有重要作用，是目前研究microRNA的重要技术。,.,60,PAGE/Northernblotting基本操作步骤,（一）总RNA的提取关键：尽量不使小RNA丢失（二）样品处理取适量提取的RNA样品于上样缓冲液及去离子甲酰胺中混匀，55孵育30min，冰浴后准备PAGE分离。（三）PAGE分离、转膜及固定,.,61,PAGE/Northernblotting基本操作步骤,（四）寡核苷酸探针的制备探针标记可选择放射性核素或非放射性荧光，其中放射性核素敏感度高，可检测较低丰度的microRNA分子（五）杂交、洗膜、压片及显影（六）如果选用放射性标记的探针，在分析结果后要去除Northern印记膜上的放射性，避免放射性污染。,.,62,MicroRNA基因芯片技术,基本原理：MicroRNA基因芯片的基本原理与以往传统基因芯片的使用原理基本相同，即经过标记的待测microRNA与芯片上特定位置的探针根据碱基互补配对原则杂交，再经特定仪器扫描，以计算机相关软件对荧光信号进行检测，并转化为可读的数字信息，最后经大量数据分析筛选出有显著表达差异的microRNA。,.,63,MicroRNA基因芯片技术,主要应用：（1）寻找和发现新microRNA基因；（2）miRNA相关疾病的诊断和治疗，如肿瘤、白血病、糖尿病等；（3）药物筛选和药物开发等；,.,64,MicroRNA基因芯片技术操作流程示意图,LiW,RuanKC.2009,.,65,MicroRNA基因芯片技术操作流程,（一）MicroRNA基因芯片的设计与制作可根据实验需要自行设计芯片，需要考虑探针的种类、点阵数目及片基种类等；也可向市面上购买芯片（二）RNA提取与纯化（三）RNA样品的标记MicroRNA芯片表达谱分析的一个前提条件是检测到所有的microRNA，并且结果具有可重复性。因此，选择合适的microRNA标记系统是实现芯片表达谱检测精确性的一个保证。,.,66,MicroRNA基因芯片技术操作流程,（四）芯片杂交及后处理由于microRNA分子量小，因此，杂交反应条件及杂交后洗脱条件需谨慎选择。（五）图像采集和数据分析MicroRNA基因芯片图像的采集和分析是microRNA芯片技术的重要环节，芯片图象获取的准确性和分析的可靠性直接影响芯片的应用。（六）验证由于microRNA基因芯片结果存在假阳性的可能性，需要用PAGE/Northernblotting、定量PCR等方法验证。,.,67,MicroRNA实时定量PCR,基本原理：利用能特异标记PCR产物的荧光物质，显示PCR产物的动态累积，得到S型的扩增曲线；假设该曲线的前期PCR符合指数性扩增，于是在单纯指数方程的基础上，通过比较产物积累的速度来间接比较初始模板的分子数。最初，实时定量PCR被用于定量检测小RNA分子的前体表达；现在，经过方法改进可用于检测成熟小RNA分子的表达。,.,68,MicroRNA实时定量PCR,主要应用：（1）microRNA的定量检测，可精确检测出细胞或组织样品中特定微量的microRNA表达水平；（2）由于该方法可以同时检测microRNA及其前体，因此，可以根据两者在不同发育阶段的表达差异情况来深入了解microRNA的起源和发生；（3）应用于临床诊断和治疗等。,.,69,TaqManMicroRNA实时定量PCR示意图,ChenCF,RidzonDA,BroomerAJ,etal.Real-timequantificationofmicroRNAsbystemloopRTPCR.NucleicAcidsRes.2005;33(20):e179,.,70,MicroRNA实时定量PCR操作步骤,（一）总RNA提取、小分子RNA的分离纯化及富集（二）逆转录反应MicroRNA的逆转录反应与普通的针对mRNA的逆转录反应过程基本相似，但也有其特异之处，如它的逆转录酶的特异性等。（三）实时定量PCR针对microRNA的实时定量PCR的热学反应条件要谨慎选择。,.,71,MicroRNA与疾病,MicroRNA与人类疾病包括肿瘤、糖尿病、炎症、心脏疾病、病毒感染等的发生密切相关。MicroRNA造成疾病发生的可能原因有：突变、基因表达失活、低效转录等原因造成的microRNA表达下调；启动子区域基因扩增或突变等原因造成的microRNA表达上调等。,.,72,microRNA引发癌症的可能原因：（1）microRNA与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，而肿瘤则是由细胞增殖、分化、凋亡功能紊乱而引发的；（2）许多microRNA的基因位于基因组中易发生断裂、移位、缺失等变异的区域；（3）与正常组织相比，在恶性肿瘤和肿瘤细胞株中普遍存在着对microRNA的表达失控,.,73,充当抑癌基因作用的miRNA:,miR-15a和miR-16-1:,这两个miRNAs的缺失或下调，促进了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。,mir-143和mir-145:在结肠癌中明显下调,充当癌基因作用的miRNA:,miR-21:在胶质母细胞瘤中表达增加,miR-155:在Burkitt淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤等肿瘤中表达上升,.,74,目前肺癌中已经表达分析及初步功能研究的部分microRNA,.,75,MicroRNA与糖尿病,MicroRNA引发糖尿病的可能原因：（1）MicroRNA参与胰岛素的合成分泌调节；（2）MicroRNA对血糖代谢起着直接或间接的调控作用；（3）MicroRNA与脂质代谢密切相关；,.,76,已知功能的部分miRNA与糖尿病的关系,AmitK.Pandey,etal.,2009,.,77,miRNA的综合信息网站：http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml,.,78,免疫共沉淀技术,.,79,.,80,.,81,.,82,.,83,.,84,.,85,.,86,.,87,.,88,.,89,.,90,.,91,.,92,.,93,.,94,.,95,.,96,.,97,.,98,.,99,.,100,.,101,.,102,参考文献1.ZhifaShen,AnikSt-DenisandPascalChartrand.CotranscriptionalrecruitmentofShe2pbyRNApolIIelongationfactorSpt4-Spt5/DSIFpromotesmRNAlocalizationtoyeastbud.GenesandDevelopment,2010,24:1914-19262.ZhifaShen,NicolasPaquin1,AmlieForgetandPascalChartrand.NuclearshuttlingofShe2pcouplesASH1mRNAlocalizationtoitstranslationalrepressionbyrecruitingLoc1pandPuf6p.Mol.Bio.Cell,2009.20,2265-2275.,.,103,RNAVisualizationinside