小麦Rubisco单克隆抗体的制备-PowerPoint文档.ppt

学生:袁秋华导师:顾蕴洁教授王忠教授,小麦Rubisco单克隆抗体的制备,Rubisco首先由Wildman和Bonner于1947年从菠菜叶中作为一种可溶性大分子蛋白质被发现，当时称为“分部I蛋白（fractionIprotein”）。后来碳同化研究发现分部I蛋白就是催化光合作用中co2固定的RuBp羧化酶。1971年发现RuBp羧化酶是一个双功能酶，它还能催化RuBp的氧化作用。此后该酶就被称为核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶，简称Rubisco。,Rubisco的发现,Rubisco的结构,所有真核和大多数原核的光合有机体中的Rubisco由8个大亚基和8个小亚基组成，大亚基一般由475个氨基酸残基组成，不同来源的Rubisco大亚基序列有80%以上的同源性，而且特别是在169220和321340之间的氨基酸残基序列，在不同有机体中几乎完全一致，现在已知这些区域含有与催化及活化过程有关的氨基酸残基。大多数Rubisco小亚基由123个氨基酸残基组成，不同植物间小亚基氨基酸序列的同源性比大亚基低得多，一般在70%左右，然而，小亚基序列中有两个区域非常保守，即残基1021和6167，暗示这些部分可能有什么重要功能。,Rubisco的结构图,核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（简称Rubisco）催化卡尔文循环中最初的CO2固定，使核酮糖-1，5-二磷酸（RuBp）与CO2形成两分子3-磷酸甘油酸。该酶也同时催化光呼吸作用中的第一个步骤，使RuBp与O2反应产生一分子磷酸甘油酸和一分子磷酸乙醇酸。因此Rubisco处于光合碳还原和光合碳氧化两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，它对净光合速率起着决定性的影响。,Rubisco的功能,Rubisco的纯化,Rubisco的纯度鉴定,利用ND-PAGE和SDS-PAGE鉴定Rubisco纯度。,Rubisco的纯度鉴定结果,Rubisco的非解离聚丙烯酰胺凝胶电泳结果,Rubisco的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果,97.4,66.2,45,31,20.1,14.4,大亚基,小亚基,Rubisco,标准蛋白,分子量（1000）,我们得到高纯度的Rubisco后，就可以制备其单克隆抗体了，下面先跟大家介绍一下单克隆抗体制备的技术。,抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonalantibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学实验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。,单克隆抗体产生的背景,1975年，Kohler和Milstein大胆地把丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。,单抗制备的原理,单克隆抗体概念,1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞地单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonalantibody），简称单抗。,单抗与多抗的比较,杂交瘤细胞的筛选,方法：,1、免疫酶技术,2、免疫荧光技术,3、间接血凝试验,4、放射免疫测定,免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性高，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。,间接血凝试验又称被动血凝试验（PHA），是目前应用较广的检测方法之一。本试验是以包被可溶性抗原的红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上的抗原产生特异性反应时，导致红细胞凝集现象。可见，该法具有灵敏、快速、容易操作和无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，克服原来重复性差的缺点。,放射免疫测定是用放射性同位素标记抗原或抗体，以检测相应抗原或抗体的定量方法。在筛选和鉴定单抗时常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以检测样品中的McAb,包被,洗涤,封闭,洗涤,加一抗,用碳酸盐Buffer将两酶抗原稀释到所需浓度，每孔加入100L，4包被过夜。,每孔加入保温液200L，37孵育3h（或4过夜）。,每孔加入经稀释液稀释的待测抗血清样品100L，同时设立阴性对照，37孵育2h。,单抗检测（间接ELISA）,用PBST洗涤3次，每次洗浸泡5分钟后拍干。,结果判定,洗涤,终止,显色,洗涤,加二抗,每孔加入稀释至工作浓度的羊抗鼠IgG二抗100L，37孵育2h。,每孔加入OPD底物溶液100L，37避光反应15min左右。,在490nm波长下测定样品的OD值，结果以PN比值表示，即将样品的OD值与阴性样品OD值的均值相比，若大于1.5倍，即判为阳性。,用2mol/L的硫酸溶液终止。,杂交瘤细胞的克隆化,a、制备小鼠腹腔细胞。同“细胞融合”一节中的方法。b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3中不同的稀释度。c、按每毫升加入5104-1105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。d、每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。e、37、7.5%CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。f、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。,（1）有限稀释法,（2）软琼脂法,a、在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。b、临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养基混匀，配成1%琼脂糖培养液，45水浴中温育。c、吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10分钟。d、取杂交瘤细胞悬液1ml，