补肾益气中药与膝骨性关节炎关节液中白细胞介素1及白细胞介素6的表达

中国组织工程研究与临床康复第14卷第50期20101210出版JOURNALOFCLINICALREHABILITATIVETISSUEENGINEERINGRESEARCHDECEMBER10,2010VOL14,NO50ISSN16738225CN211539/RCODENZLKHAH9391RESEARCHINSTITUTEOFORTHOPEDICSANDTRAUMATOLOGY,SHAANXIUNIVERSITYOFCHINESEMEDICINE,XIANYANG712000,SHAANXIPROVINCE,CHINAYUANPUWEI,DOCTOR,ASSOCIATEPROFESSOR,ASSOCIATECHIEFPHYSICIAN,RESEARCHINSTITUTEOFORTHOPEDICSANDTRAUMATOLOGY,SHAANXIUNIVERSITYOFCHINESEMEDICINE,XIANYANG712000,SHAANXIPROVINCE,CHINASPINE_SURGEON163COMSUPPORTEDBYTHESCIENTIFICRESEARCHPLANPROJECTSOFSHAANXIEDUCATIONDEPARTMENT,NO09JK411RECEIVED20100623ACCEPTED20100712陕西中医学院骨伤研究所，陕西省咸阳市712000袁普卫，男，1979年生，医学博士，副教授，副主任医师，主要从事中西医结合骨科方面的研究。SPINE_SURGEON163COM中图分类号R318文献标识码B文章编号167382252010500939104收稿日期20100623修回日期2010071220100510022/YJZ补肾益气中药与膝骨性关节炎关节液中白细胞介素1及白细胞介素6的表达袁普卫，刘德玉，杨镇源，楚向东，郝阳泉，朱超，屈强EFFECTOFCHINESEMEDICINEREPLENISHINGKIDNEYANDINVIGORATINGQIONEXPRESSIONOFINTERLEUKIN1ANDINTERLEUKIN6INSYNOVIALFLUIDOFKNEEOSTEOARTHRITISYUANPUWEI,LIUDEYU,YANGZHENYUAN,CHUXIANGDONG,HAOYANGQUAN,ZHUCHAO,QUQIANGABSTRACTBACKGROUNDOSTEOARTHRITISCANBERELEASEDORDELAYEDRATHERTHANCUREDATPRESENTOBJECTIVETOEXPLORETHEMECHANISMOFCHINESEMEDICINEWITHREPLENISHINGKIDNEYANDINVIGORATINGQIONPREVENTIONOFOSTEOARTHRITISMETHODSLONGEAREDWHITERABBITS,AGED4MONTHS,WERERANDOMLYDIVIDEDINTOSIXGROUPS,CONTROL,MODEL,TRADITIONALCHINESEMEDICINEHIGH,MIDDLE,ANDLOWDOSEANDGLUCOSEAMINOACIDHYDROCHLORIDECAPSULESGROUPSALLANIMALSWEREESTABLISHEDOSTEOARTHRITISMODELANDTREATEDBYTRADITIONALCHINESEMEDICINEWITHDIFFERENTDOSESORGLUCOSEAMINOACIDHYDROCHLORIDECAPSULESFOR4WEEKSTHEVARIATIONSOFINTERLEUKIN1ANDINTERLEUKIN6INJOINTFLUIDEXTRACTIONWEREDETERMINEDBYELISAGROSSANDLIGHTMICROSCOPEOBSERVATIONSWEREPERFORMEDONARTICULARCARTILAGESRESULTSANDCONCLUSIONTHEARTICULARCARTILAGEHADVARYINGDEGREEDEGENERATION,OSTEOPHYTEANDBONECYSTSFORMEDANDDEFECTSDEEPINTOMIDDLEZONEOFPARTSOFCARTILAGESAFTERTREATMENTCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUP,THESYNOVIALFLUIDINTERLEUKIN1ANDINTERLEUKIN6LEVELSWEREOBVIOUSLYDECREASEDINTHETRADITIONALCHINESEMEDICINEHIGH,MIDDLE,ANDLOWDOSEANDGLUCOSEAMINOACIDHYDROCHLORIDECAPSULESGROUPSP005,ANDTHEDECREASEDDEGREEBECAMEGREATERWITHDOSEINCREASINGCHINESEMEDICINEWITHREPLENISHINGKIDNEYANDINVIGORATINGQICANPREVENTOSTEOARTHRITISVIAREDUCINGSYNOVIALFLUIDINTERLEUKIN1ANDINTERLEUKIN6LEVELSYUANPW,LIUDY,YANGZY,CHUXD,HAOYQ,ZHUC,QUQEFFECTOFCHINESEMEDICINEREPLENISHINGKIDNEYANDINVIGORATINGQIONEXPRESSIONOFINTERLEUKIN1ANDINTERLEUKIN6INSYNOVIALFLUIDOFKNEEOSTEOARTHRITISZHONGGUOZUZHIGONGCHENGYANJIUYULINCHUANGKANGFU2010145093919394HTTP/WWWCRTERCNHTTP/ENZGLCKFCOM摘要背景对骨性关节炎的治疗目前尚无逆转和阻断的有效方法，只能缓解症状和延缓病变的进程。目的探讨补肾益气法中药预防家兔膝骨性关节炎的作用机制。方法4月龄健康日本长耳大白兔随机分为对照组、模型组、中药大、中、小剂量组、盐酸氨基葡萄糖胶囊对照组。造成兔膝骨性关节炎模型同时分别给予不同剂量中药及盐酸氨基葡萄糖胶囊灌胃4周，应用酶联免疫吸附法测定关节液中白细胞介素1及白细胞介素6的变化，同时取关节软骨行大体及光镜检查。结果与结论治疗后动物关节软骨有不同程度的色泽变化，骨赘、骨囊肿形成，软骨关节面出现浅表性糜烂，部分标本软骨缺损深达软骨中层，出现软骨剥脱，但程度明显降低。中药大、中、小剂量组及盐酸氨基葡萄糖胶囊对照组关节液中白细胞介素1及白细胞介素6水平均显著降低P005，且随用药剂量增大，兔关节液中白细胞介素1及白细胞介素6水平降低幅度增强。提示补肾益气法中药可能通过降低兔关节液中白细胞介素1及白细胞介素6水平，来达到预防骨性关节炎的发生。关键词补肾益气法；骨性关节炎；预防；白细胞介素1；白细胞介素6DOI103969/JISSN16738225201050020袁普卫，刘德玉，杨镇源，楚向东，郝阳泉，朱超，屈强补肾益气中药与膝骨性关节炎关节液中白细胞介素1及白细胞介素6的表达J中国组织工程研究与临床康复，2010，145093919493HTTP/WWWCRTERORGHTTP/CNZGLCKFCOM0引言骨性关节炎OSTEOARTHRITIS，OA主要侵害关节软骨、骨和滑膜组织，导致关节疼痛、畸形和功能障碍1。膝关节的OA患者出现关节软骨退变、破坏，继而出现滑膜和软骨下骨质病变，致使下肢功能的丧失。但目前尚无逆转和阻断其病理过程有效方法，只能缓解症状和延缓病变的进程。作者所在课题组认为肝肾两亏，气血双虚，筋骨不坚乃为OA的主要病理机制，临床上以补肾益气为法，采用中药复方蠲痹胶囊预防和治疗早期OA，取得了明显的效果23。氨基葡萄糖可以刺激软骨细胞产生有正常多聚体结构的蛋白多糖，提高软骨细胞的修复能力，可以促进软骨基质的修复和重建，从而延缓骨关节疼痛的病理过程和疾病的进程4。本次实验通过蠲痹胶囊与盐酸氨基葡萄糖胶囊比较，观察中药复方蠲痹胶囊对于膝骨性关节炎关节液中白细胞介素1及白细胞介素6表达的影响。1材料和方法设计开放性实验。袁普卫，等补肾益气中药与膝骨性关节炎关节液中白细胞介素1及白细胞介素6的表达POBOX1200,SHENYANG110004CNZGLCKFCOM9392WWWCRTERORG时间及地点实验于200909/201002在陕西中医学院中医药生物技术和免疫学实验中心完成。材料实验动物4月龄健康日本长耳大白兔72只，雄性，体质量为2835KG，由陕西省西安交通大学医学院实验动物中心提供,许可证号SCXK陕2008008。各组兔实验前在动物室饲养1周，室温下饲养进食、饮水不限。实验过程符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的关于善待实验动物的指导性意见的要求5。药物蠲痹胶囊由熟地、生黄芪、淫羊藿、骨碎补各15份，肉苁蓉、牛膝各10份，甘草6份组成，由陕西中医学院附属医院中药房提供，加水10倍量煎煮提取2次，合并提取液，减压浓缩汁相对密度为1150，加乙醇沉淀，使乙醇浓度达60，取上清液，减压回收乙醇，减压浓缩干燥，粉碎成细粉备用，临用前取相应剂量药粉加水溶解进行给药。试剂及仪器实验方法动物分组72只实验动物随机均分为对照组、模型组、中药大剂量组、中药中剂量组、中药小剂量组、盐酸氨基葡萄糖胶囊对照组，各12只。造模方法采用石膏管形固定致兔膝骨性关节炎模型造模方法。将家兔左侧膝关节伸直位石膏外固定6周，使左侧膝关节不能活动，制作膝骨性关节炎模型，6周后去除石膏。灌胃方案从造模的第1天开始灌胃，共持续4周，中药大、中及小剂量组每日分别以相当于临床成人剂量20倍相当于生药量120G、10倍相当于生药量60G及6倍相当于生药量36G的补肾益气方药灌胃，分早晚2次灌服。盐酸氨基葡萄糖胶囊组每日以相当于临床成人剂量5倍相当于生药量30G的盐酸氨基葡糖糖胶囊灌胃，分早晚2次灌服。模型组每日以与用药组等体积2ML/D的生理盐水灌胃，分早晚2次灌服；对照组不灌胃。大体观察包括动物的一般情况，如体质量、精神、毛发光泽度，尿便及膝关节关节软骨大体形态。组织形态学造模6周后，将各组实验动物处死，解剖患侧膝关节，迅速切除患侧股骨内髁关节软骨修成05CM05CM05CM大小的组织块，立即置于40G/L甲醛中固定，再移入脱钙液脱钙、梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋。同时取部分滑膜采用常规苏木精伊红染色，光学显微镜观察药物干预后各组关节软骨及滑膜组织病理学变化。关节液中白细胞介素1及白细胞介素6水平测定给药4周，膝关节伸直位石膏外固定6周后，采用耳缘静脉注射10乌拉坦05G/KG麻醉后，向兔左膝关节内注射01ML生理盐水，反复抽吸后，抽取关节液约06ML，置入4000R/MIN离心10MIN，取上清液约03ML，20冰箱保存待测。应用酶联免疫吸附法测定样本中白细胞介素1及白细胞介素6的变化。主要观察指标应用光学显微镜观察药物干预后各组关节软骨组织病理学变化，应用酶联免疫吸附法测定样本中白细胞介素1及白细胞介素6的变化。设计、实施、评估者设计是第一、二作者；实施是第三、第四及第六作者；评估是第五、第七作者。均经过系统培训，采用盲法评估。统计学分析由第五、第七作者采用SPSS120软件进行统计处理，数据以X_S表示。2结果21实验动物数量分析实验动物无脱落，全部进入结果分析。22动物一般情况对照组大白兔精神状态良好，毛色无异常变化，对外界的刺激较敏感，造模膝关节石膏托固定稳妥。模型组大白兔毛色枯稿，无光泽，自发活动明显减少，对外界刺激的敏感性显著降低，造模膝关节石膏托固定稳妥。中药组及氨基葡萄糖组大白兔精神状态较模型对照组好，毛色较模型对照组润泽，对外界刺激较敏感，自发活动较模型组增多，造模膝关节石膏托固定稳妥。23光镜下观察结果对照组兔膝关节软骨外观呈蓝白色，色泽明亮，表面光滑无软化及龟裂，无软骨缺损，有湿润感，触之较硬，滑膜色泽正常。模型组兔膝关节软骨发生了显著的形态学改变，关节软骨明显失去原有光泽、发黄、不透明，软骨表面不完整、较粗糙，触之较软，负重区域出现糜烂溃疡面，基底较深，可深达软骨全层，出现不同程度的软骨剥脱，软骨下骨外露，骨赘生成，软骨滑膜存在不同程度肿胀、充血。预防治疗各组动物关节软骨有不同程度的色泽变化，骨赘、骨囊肿形成，软骨关节面出现浅表性糜烂，部分标本软骨缺损深达软骨中层，出现软骨剥脱，但程度明显低于模型组，见图1。试剂及仪器来源盐酸氨基葡萄糖胶囊产品批号20090503，批准文号国药准字H20060748兔白细胞介素1、白细胞介素6酶联免疫分析试剂盒HB2型奥林帕斯显微镜、CBQ型硬质材料超薄切片机及高速DL8R低温冷冻离心机、ELX808IU酶标仪浙江诚意药业有限公司美国RBP005,VSMODELGROUPCP005,VSTRADITIONALCHINESEMEDICINEHIGHDOSEGROUPDP005,VSTRADITIONALCHINESEMEDICINEMIDDLEDOSEGROUPEP005,VSTRADITIONALCHINESEMEDICINELOWDOSEGROUPGROUPINTERLEUKIN1INTERLEUKIN6CONTROL860090010012MODEL321588605A249963720ATRADITIONALCHINESEMEDICINEHIGHDOSE9121432B47451737BTRADITIONALCHINESEMEDICINEMIDDLEDOSE12477178BC98951194BCTRADITIONALCHINESEMEDICINELOWDOSE158121119BCD157881633BCDGLUCOSEAMINOACIDHYDROCHLORIDECAPSULES113341051E98331231CECTRADITIONALCHINESEMEDICINELOWDOSEGROUPDGLUCOSEAMINOACIDHYDROCHLORIDECAPSULESGROUPEMODELGROUPFCONTROLGROUP袁普卫，等补肾益气中药与膝骨性关节炎关节液中白细胞介素1及白细胞介素6的表达POBOX1200,SHENYANG110004CNZGLCKFCOM9394WWWCRTERORG理上，肝肾同病母病及子、子盗母气；治疗上，滋水涵木，补肝往往以补肾为主；正如李中梓所言“乙癸同源，东方之木无虚不可补，补肾即所以补肝；北方之水，无实不可泻，泻肝即所以泻肾”。本课题组根据多年临床体会，认为肝肾两亏，气血双虚，筋骨不坚乃为本病的主要病机，临床以补肾益气为法，对缓解早期OA患者疼痛及延缓病情发展取得满意的防治作用30。本次实验表明，补肾益气方有效改善兔膝OA症状，明显降低膝关节滑液中的白细胞介素1及白细胞介素6水平，这可能与本方对关节软骨起保护和修复作用有关。实验中模型组兔软骨表面碎裂、剥脱，滑膜增生、粘连，软骨细胞簇集和坏死，蠲痹胶囊大、中、小剂量防治组兔软骨和滑膜在病理程度上的改变明显，较模型组有不同程度减轻，软骨结构较完整，软骨细胞形态改变较小，提示蠲痹胶囊可缓解软骨细胞的退变和软骨基质的降解。由此推测补肾益气法中药可能通过降低家兔关节液中白细胞介素1、白细胞介素6水平及延缓关节软骨退变的作用来预防及早期治疗OA。4参考文献1QIUGXJIXUYIXUEJIAOYU20051976869邱贵兴骨关节炎流行病学和病因学新进展J继续医学教育,2005,19768692LIUDYSHANXIZHONGYIXUEYUANXUEBAO199922119刘德玉李堪印教授治疗骨性关节炎临床经验J陕西中医学院学报,1999,221193LIK,JIAYS,LIUDYSHANXIZHONGYIXUEYUANXUEBAO20052814748李凯,贾永森,刘德玉中西医结合治疗膝骨性关节炎56例J陕西中医学院学报,2005,28147484ZHENGYX,SHIYYZHONGGUOZHONGYIGUSHANGKEZAZHI20051356869郑昱新,石印玉氨基葡萄糖治疗骨关节炎的现状J中国中医骨伤科杂志,2005,13568695THEMINISTRYOFSCIENCEANDTECHNOLOGYOFTHEPEOPLESREPUBLICOFCHINAGUIDANCESUGGESTIONSFORTHECAREANDUSEOFLABORATORYANIMALS20060930中华人民共和国科学技术部关于善待实验动物的指导性意见200609306OKAZAKIR,SAKAIA,OOTSUYAMAA,ETALAPOPTOSISANDP53EXPRESSIONINCHONDROCYTESRELATETODEGENERATIONINARTICULARCARTILAGEOFIMMOBILIZEDKNEEJOINTSJRHEUMATOL20033035595667ZHONGHX,HUANGTXIANDAIKANGFU20015136钟汉馨,黄涛不同运动方式引起关节软骨改变的病理研究J现代康复,2001,51368WEIL,HJERPEA,BRISMARBH,ETALEFFECTOFLOADONARTICULARCARTILAGEMATRIXANDTHEDEVELOPMENTOFGUINEAPIGOSTEOARTHRITISOSTEOARTHRITISCARTILAGE2001954474539POMONISJD,BOULETJM,GOTTSHALLSL,ETALDEVELOPMENTANDPHARMACOLOGICALCHARACTERIZATIONOFARATMODELOFOSTEOARTHRITISPAINPAIN2005114333934610BADGERAM,GRISWOLDDE,KAPADIAR,ETALDISEASEMODIFYINGACTIVITYOFSB242235,ASELECTIVEINHIBITOROFP38MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASE,INRATADJUVANTINDUCEDARTHRITISARTHRITISRHEUM200043117518311SONGZK,CHENGWZZHONGGUOGUSHANG2003165344347宋震坤,陈文照环氧化酶2与关节炎J中国骨伤,2003,16534434712MOXLEYG,MEULENBELTI,CHAPMANK,ETALINTERLEUKIN1REGIONMETAANALYSISWITHOSTEOARTHRITISPHENOTYPESOSTEOARTHRITISCARTILAGE201018220020713COLEWIL1POLYMORPHISMSMAYPREDISPOSEDISTALINTERPHALANGEALJOINTSOFTHEHANDSTOEFFECTSOFMECHANICALOVERLOADJRHEUMATOL20093691864186514CLUTTERBUCKAL,MOBASHERIA,SHAKIBAEIM,ETALINTERLEUKIN1BETAINDUCEDEXTRACELLULARMATRIXDEGRADATIONANDGLYCOSAMINOGLYCANRELEASEISINHIBITEDBYCURCUMININANEXPLANTMODELOFCARTILAGEINFLAMMATIONANNNYACADSCI2009117142843515MOKTARNM,YUSOFHM,YAHAYANH,ETALTHETRANSCRIPTLEVELOFINTERLEUKIN6INTHECARTILAGEOFIDIOPATHICOSTEOARTHRITISOFKNEECLINTER20101611252816XUFY,GANJH,LIWP,ETALEFFECTOFELECTROACUPUNCTUREONTHELEVELOFIL1BETAANDTNFALPHAINPATIENTSWITHOSTEOARTHRITISZHONGGUOZHENJIU200929752953117SUNZM,LINGM,LIUM,ETALEXPRESSIONOFINTERLEUKIN1BETAANDTUMORNECROSISFACTORALPHAINTHESYNOVIUMANDSYNOVIALFLUIDOFPATIENTSWITHKASHINBECKDISEASEANDOSTEOARTHRITISNANFANGYIKEDAXUEXUEBAO20092915818ZHENGJP,LICYZHONGGUOSHIYONGYIYAO200941557郑剑平,利春叶白细胞介素1在骨性关节炎的水平及作用J中国实用医药,2009,4155719SEIFARTHC,CSAKIC,SHAKIBAEIMANABOLICACTIONSOFIGFIANDTGFBETA1ONINTERLEUKIN1BETATREATEDHUMANARTICULARCHONDROCYTESEVALUATIONINTWOANDTHREEDIMENSIONALCULTURESHISTOLHISTOPATHOL200924101245126220ZHOUPH,LIUSQ,PENGHTHEEFFECTOFHYALURONICACIDONIL1BETAINDUCEDCHONDROCYTEAPOPTOSISINARATMODELOFOSTEOARTHRITISJORTHOPRES200826121643164821PRITCHARDS,VOTTABJ,KUMARS,ETALINTERLEUKIN1INHIBITSOSMOTICALLYINDUCEDCALCIUMSIGNALINGANDVOLUMEREGULATIONINARTICULARCHONDROCYTESOSTEOARTHRITISCARTILAGE200816121466147322KIMSJ,KIMEJ,KIMYH,ETALTHEMODULATIONOFINTEGRINEXPRESSIONBYTHEEXTRACELLULARMATRIXINARTICULARCHONDROCYTESYONSEIMEDJ200344349350123LIUSF,LIYH,XUTCZHONGGUOLINCHUANGKANGFU200485938939刘淑芳,李莹辉,徐团才骨性关节炎的生化及病理变化J中国临床康复,2004,8593893924MALEMUDCJANTICYTOKINETHERAPYFORO