体外受精技术PPT演示课件

体外受精技术,1,体外受精的概念,狭义：将动物受精过程中的精卵结合在体外环境下完成的现象。包括自然条件下的体外受精(两栖类和鱼类)，和人为培养条件下的体外受精(哺乳动物)。广义：经过特殊处理的精子在体外使卵母细胞受精的技术，所以体外受精的胚胎移植后所生婴儿又称为“试管婴儿”。包括卵母细胞的体外成熟和受精卵的体外培养两项配套技术。优点：与体内受精相比，所需精子数减少，提高精液利用率。Example:流式细胞含仪分离的性控精子只能用于体外受精。,2,国内外研究现状,1878年，Schenk(Germany)将体内成熟的家兔和豚鼠卵子与附睾精子放入子宫液中培养，观察到第二极体的排出和卵裂现象；1945年，张明觉(华裔)偶然获得兔体外受精卵，但无重复性，且无试管动物出生；1951，张明觉与Austin(澳)同时发现精子获能现象；1959年，他首次获得体外受精兔；80年代以来，对胚胎需求量的加大，促进了家畜体外受精的研究，牛、绵羊、山羊、猪等体处胚相继获得了成功，国内90年代在家畜上也获得了成功；现已将卵母细胞体外成熟-体外受精-早期胚体外发育-冷冻保存结合在一起，建立工厂化胚胎生产。,3,国内外研究现状,世界体外受精的首创纪录动物种类首创纪录文献兔Thibault(1954)叙利亚仓鼠Yanaginmachi,chang(1963)小鼠Whittingham(1968)中国仓鼠Pickworth,Chang(1969)猫Hammer(1970)土拨鼠Yanagimachi(1972)大鼠Miyamoto,Chang(1973)狗Mahi,Yanagimachi(1976)牛Brackett(1978)猪Iritani,Niwa(1977)绵羊Bondioli,Wright(1980)山羊花田章(1985),4,国内外研究现状,我国体外受精的首创纪录动物种类首创纪录文献小鼠陈秀兰(1986)兔范必勤(1987)绵羊旭日干(1989)牛旭日干(1989)山羊钱菊汾(1990)猪范必勤(1990)水牛蒋和生(1993),5,体外受精技术流程,卵母细胞的体外成熟精子的体外获能卵母细胞的体外受精受精卵的体外发育配子的冷冻保存,6,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的采集与体外培养,1.离体采集：30min内取卵巢，置生理盐水或PBS（25-35），3h内回收。卵泡抽吸法：针头穿刺，一次进针可抽吸卵巢皮质的多个卵泡优点：回收速度快，不易造成卵母细胞的污染；缺点：容易损伤卵母细胞周围的卵丘细胞，影响其随后的成熟。,7,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的采集,卵巢解剖法：卵巢切为两半，去掉中间的髓质部分，刀片划破卵泡，在培养液中反复冲洗优点：能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回收率也相对较高；缺点：回收的速度相对较慢，容易造成污染。,8,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的采集,2.活体采集(OvumPick-Up,OPU)腔镜法：腹壁切开一小口，插入腹腔镜，操作杆和穿刺针，配合将卵母细胞抽吸出来优点：比较直观，容易掌握；缺点：工作量大，对母牛有损伤，不能频繁手术。,9,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的采集,B型超声波法：超声波探头和采卵器插入到阴道子宫颈的一侧穹隆处。术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据B超屏幕上所显示的卵泡位置进行穿刺而将卵母细胞抽出优点：不用手术，操作速度快，对母牛损伤小，可频繁采卵，且亦可对妊娠母牛采卵；缺点：操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设备。,10,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的筛选,只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落（B级）(1层以上卵丘细胞）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟与胚胎发育的培养。A级：卵丘细胞致密，至少有5层以上；B级：卵丘细胞为2-4层；C级：卵母细胞大部分被包裹；D级：卵母细胞少量被包裹；E级：裸卵。A、B级可用于培养，C、D级成熟率低。,11,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,卵母细胞成熟目的：提供可利用的卵母细胞用于体外受精、克隆等；研究其体内成熟的模型。卵母细胞体外成熟的特征生发泡破裂；染色体凝集；纺缍体形成；极体排出；透明带软化；卵丘细胞扩展。,12,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,卵母细胞成熟培养液以TCM-199较好，可使牛、羊、猪的卵母细胞体外成熟率高达80%以上。添加成分：促性腺激素：FSH、LHFCS、BSA：有认为FCS比BSA好，而发情牛血清或发情羊血清比FCS好。抗生素,13,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟培养,OocyteCollectionMedium(OCM)最常用的是碳酸氢钠或Hepes缓冲的TCM-199;,2.OocyteMaturationMedium（1)Bovinesteerserum(2)Folltropin(3)Estradiol(4)NaPyruvate(5)Glutamine,14,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟培养,2.成熟培养时间一般22h-24h，但猪40h-44h，马30h-36h，兔仅12h-15h3.成熟培养的温度和气相环境人和啮齿类动物：37牛、猪、羊和马等：3839。pH：7.7好于7.1，7.4，8.0渗透压：330Osm/kg好于300，320气相：5%CO25%CO25%O290%N2,15,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟培养,4.IVM系统开放培养系统1ml-2ml成熟培养液直接置于平皿内或培养板内，放入50枚-200枚卵母细胞培养，上面不盖石蜡油。优点：简单，对培养液中的脂溶性物质没有若影响，能同时培养大量细胞缺点：渗透压变化较大，容易污染,16,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟培养,微滴培养系统将成熟培养液在做成50-500l的微滴，覆石蜡油，将卵母细胞置于其中培养。优点：渗透压比较稳定，不易污染；缺点：对脂溶性物质有稀释作用，成本高，培养结果易受石蜡油质量的影响。密闭培养系统置12ml培养液的试管中，胶塞，在培养箱或恒温水浴中培养；若采用培养皿或微滴培养，则可将其装入密闭的塑料袋内。优点：不要CO2培养箱，方便运输缺点：pH不如前者稳定。,17,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,卵母细胞成熟的标志第一极体的排出、卵丘细胞的扩展可作为成熟的标志，而生发泡破裂(GVBD)是卵母细胞恢复减数分裂的主要标准，因此常用地衣红染色才可判断。牛卵母细胞体外成熟标准：1级成熟卵：卵丘细胞完全扩展，卵丘细胞至少向外扩展3倍于裸卵直径；2级成熟卵：卵丘细胞中等扩展，卵丘细胞至少向外扩展2倍于裸卵直径；3级成熟卵：卵丘细胞轻度假扩展，卵丘细胞仍紧紧粘附于透明带上。1级和2级卵通常均已排出第一极体。,18,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞体外成熟的质量评定,形态观察：细胞质均匀、没有空泡固定染色法：0.1%透明质酸酶醋酸酒精或醋酸甲醇（1:3）固定24h48h1%间苯二酚兰（Lacmoid）或1%地衣红（Orcein）的40%醋酸溶液染色受精和胚胎发育潜能的评定,19,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,影响卵母细胞成熟的因素卵母细胞的来源：不同种类的动物、不同生理阶段的动物(小牛低于成年牛)、卵母细胞的质量等；（1）动物种类与年龄：牛、羊效果较好，而马、猪较差。小牛卵母细胞的平均直径（118.041.15m）比成年母牛的（122.840.74m）小。体外成熟的小牛卵母细胞体外受精后发育潜力也低于成年卵母细胞,20,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,（2）卵母细胞的形态A、76.2%；B、67%；C、22%；D、11.4%（3）卵巢贮存时间与温度30C对成熟和胚胎发育不利(First5min)anddiscardallbutthebottom1mlofsupernatant.4.Prepare4to5testtubescontaining1mlSp-TALP.Addapproximately250mlofspermsuspensionveryslowlytothebottomofeachtubeusinga20gaugeneedleand1mlsyringe.Placetubesinincubator(38.5C)for1h.5Attheendofspermswim-up,aspiratethetop800mlfromeachtubeandcombinesamples.Centrifuge(1000rpm)thecombinedsamplefor5minutes.Discardallbutthebottom500mlofsupernate.,37,体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,Glass-woolFiltrationThisfiltrationprocedureusuallyrequires10-15minutesandgenerallyyieldsnearly100%viablesperm.1.Prepareinadvance0.2mlglasswoolcolumnsin1mlsyringesthatarerinsed10XwithMilli-Qwaterandautoclaved.2.Immediatelybeforestartingpurification,rinsecolumnseveraltimeswithHepes-TALPandfinallywithSperm-TALPtoequilibratecolumn.3.Frozen-thawedsemen(3-5straws)iswashedtwicewith10-15mlSperm-TALPbycentrifugationat200 xg(10min)andthenresuspendedin0.6-0.8mlIVF-TALP.4.Spermsuspensionisthenlayeredoverthewetcolumnandallowedtofilterbygravity.5.Thenumberandviabilityoffilteredspermisdetermined.,38,体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,39,Thawstraw,LayeringofspermontoPercoll.Aftercuttingthetipofthestraw(Leftpanel),thecontentsofthestrawareexpelledontothetopofthePercollgradient(rightpanel).Here,removalofthesemenisfacilitatedbyusingahomemadeplunger.,Percollgradient:uptobottom45-90%,40,RemovalofspermfromthebottomofthePercollgradient.,WashingsperminSp-TALP.Theleftpanelshowsthewashedandcentrifugedsperm.Therightpanelshowsthepelletofspermremaininginthetubeafteraspirationofthesupernatant.,Percollmethod,41,Hemacytometerusedforcountingsperm.,42,体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,2.精子的体外获能(1)卵泡液孵育法：卵泡液含有来自血清的大分子物质，并含有诱发精子获能和顶体反应的因子，故在精液中添加一定浓度的卵泡液可使精子获能。但不能用于体外受精(卵裂率和囊胚率下降)。(2)钙离子载体法：钙离子载体A23187能诱发Ca进入精子细胞内，诱发精子的超活化和顶体反应，从而导致获能。但其作用时间和浓度对于获能非常关键。,43,体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,(3)肝素法：它与精子孵育后，能引起Ca进入精子内，导致获能。这是被广泛采用的获能法。原来将肝素(100mg/ml)获能液预处理精液，再受精，现在直接将肝素(50mg/ml)添加到受精液中受精。实际操作时，常将多种因素共同使用，如咖啡因-肝素-BSA系统。,44,体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,3.精子获能的检测(1)精子形态及运动方式改变(常用)：获能后的精子头部膨大，运动增强。(2)顶体反应的检测：双重染色法：取样固定染色(快绿FCF和曙红)涂片干燥观察若头部有厚的蓝绿区为无获能，若出现粉经为获能。电镜法：,45,2.体外授精授精通常在覆盖下的微滴中进行，微滴以50-100ul，一般每滴中加5-10个卵母细胞，精子最终浓度为1X106个/ML。培养条件：5%CO2、39C培养，BO液中6-8h，TALP液中18-24h。,体外胚胎生产技术要点,精子的体外获能与体外受精(牛),46,1.Removeplatescontainingmaturedoocytesfromtheincubatorandplaceontheslidewarmer.2.Add25mlspermpreparationand25mlPHEmixintoeachwell.Whenpipettingthesperm,placethepipetteinthemiddleofthespermsuspensionratherthanonthebottomtoavoidgrabbingdebristhatcansettletothebottomofthetube.3.Return4-wellplatetoincubatorfor8-10h.Manypeopledofertilizationfor18-20h.WhenwewereestablishingIVFinourlab,8-10hgavebetterresultsthanlongerincubationtimes.Recently,however,wehavegottengoodresultswith18-20hfertilizationtimes.Inaddition,longerfertilizationtimesmakeiteasiertoremovecumuluscellsafterfertilization.Todeterminetheincidenceofparthenogenesis,onewellshouldbepreparedwithoutsperm,butwithPHE.After810h,placetheseoocytesintoaseparateculturemediumdropandculturefor2daysbeforelookingatrateofparthenogenesis.,体外胚胎生产技术要点,体外受精,47,体外胚胎生产技术要点,早期胚胎的体外发育,阻滞期：各种动物的早期胚胎体外发育时都存在阻断期，因此可通过改善培养条件和在培养液中添加生长因子(TGF-或bFGF等)或细胞外基质因子克服阻断。但目前的发育率仍然比较低，约为40%，是限制体外受精应用的一个突出问题。各种动物阻断期：牛：猪：羊：,48,体外胚胎生产技术要点,早期胚胎的体外发育,培养液添加的成分：(1)丙酮酸钠和乳酸钠：作为能量底物。(2)生物体液和蛋白质：FCS、NCS、发情母畜血清、BSA等。(3)激素：PMSG、FSH、胰岛素、雌激素等，提高囊胚率。(4)生长因子及多肽：IGF，促进卵母细胞的成熟、受精和早期胚胎发育；EGF促进胚胎的分化和囊胚的形成；TGF促使牛的胚胎通过早期阻断；LIF(白血病抑制因子)提高孵化囊胚发育率，并抑制胚胎干细胞的体外分化。,49,体外胚胎生产技术要点,早期胚胎的体外发育,2.胚胎的体外培养系统常规培养系统：微滴法和培养板法。输卵管离体培养法：克服阻断，但因繁琐不常用。与体细胞共培养：如输卵管上皮细胞、滋养层细胞、颗粒细胞、子宫内膜细胞等。,50,体外胚胎生产技术要点,胚胎的冷冻保存,常规的慢速冷冻法冷冻液:1.5M甘油+0.25M蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP1.5M乙二醇+0.25蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP冷冻方法：在室温下，先将牛胚胎放入防冻液中平衡一段时间；装管；以每分钟1的速度降温至7；植冰；以每分钟0.5的速度降温至35；平衡10分钟后，投入液氮中保存。,51,体外胚胎生产技术要点,胚胎冷冻保存,2.玻璃化冷冻冷冻液：EFS40：40%乙二醇+0.3M蔗糖+18%聚蔗糖+PBSS冷冻步骤：首先将胚胎放入20%乙二醇溶液（EFS20）中平衡5min；用移卵管移入玻璃化溶液中平衡10min；装管，封口；将细管投入液氮冷冻保存。,52,影响体外受精的因素,卵母细胞的成熟精子的体外获能,53,（一）卵母细胞的成熟度,54,（二）精子体外获能,55,（三）公畜的影响,56,Someinstrumentsusedtopickupembryosandoocytes.Fromlefttorightarea1ccsyringewithanextensionofrubbertubingconnectedtoaUnopette,awiretrol(fromDrummondScientific),thesamedeviceas#1withouttherubbertubingextensionanda5mlDrummondMicrodispenser.,57,Useofthewiretrolusingtwohands(leftpanel)oronehand(rightpanel).,58,TwomethodsforusingtheUnopettetip.ThedeviceontheleftpanelhasbeenmodifiedtoincludeapieceofrubbertubingbetweentheUnopetteandsyringetogivethetechniciangreatercontroloverthevolumeaspirated.,59,(A)OnaPetri-dish(i.e.Intergridplate)place3microdropsof70lholdingmediumsidebyside.(B)Placeoneblastocystintothemiddledrop(C(C-D)Insertthecottonplugsideofa0.25mlFrenchstrawintothewideendofthepipettip.D(E)Aspirateoneemptydrop.A(E)Aspirateairtocreatea0.5cmcolumnA(F)Aspiratethemicrodropcontainingembryo(makesurethattheembryoisaspiratedbyobservingunderthemicroscope;A(F)Aspirateairtocreatea0.5cmcolumnh(G)Aspiratetheremainingemptydropuntilthecottonplugiswet.R(H)Removetransferstrawfromsyringeandplaceonslidewarmeruntiluse.,60,Whoshouldbetreatedwithinvitrofertilization?Invitrofertilizationcanbeusedasaneffectivetreatmentforinfertilityofallcausesexceptforwomenwithinfertilitycausedbyananatomicproblemwiththeuterus,suchassevereintrauterineadhesions.Itisgenerallyusedincoupleswhohavefailedtoconceiveafteratleastoneyearoftryingwhoalsohaveoneormoreofthefollowing:1.Blockedfallopiantubesorpelvicadhesionswithdistortedpelvicanatomy.WomenthathavehadtuballigationandareconsideringtubalreversalsurgeryaswellasmenthatareconsideringvasectomyreversalsurgerymightalsoconsiderIVF.2.Severemalefactorinfertility(lowspermcountorlowmotility)3.Failed2-6cyclesofovarianstimulationwithintrauterineinsemination,61,Whoshouldbetreatedwithinvitrofertilization?4.Advancedfemaleage-over385.Reducedovarianreserve,whichmeanslowerquantity(andsometimesquantity)ofeggs.Aday3FSHandestradioltestandantralfolliclecountsareoftendoneasscreeningtestsforeggquantity(andquality).ReducedeggquantityandqualityisusuallytreatedwitheitherIVF,orwithIVFusingeggdonationfromanotherwoman.6.Severeendometriosis,62,Thegraphshowslivebirthratesforall23reportingIllinoisIVFcentersfor2002Theseclinicsreportedlivebirthratesrangingfrom13.5%to47.4%pereggretrievalforwomenunder35FiveIllinoisIVFprogramsfailedtoreporttheiroutcomedatatothegovernment(USlawrequiresreportingannually),63,Howisinvitrofertilizationperformed?1.BasicscreeningtestsareperformedonbothpartnersatallIVFclinics.Ingeneral,sometestingofovarianreserveshouldbedoneonthefemalepriortostartingtheinjections.Weuseday3FSHtestingaswellasantralfolliclecountsforthispurpose.Theresultsofthesetestsgiveussomeabilitytopredictwhetherherovarieswillrespondwelltothedrugs(makesufficientfolliclesandeggs).ThenumberofeggsretrievedcorrelatesstronglywithIVFsuccessrates.2.Consentsaresignedbyallparties.3.Thewomanisstimulatedwithinjectedmedicationstodevelopmultipleeggdevelopment.Theseinjectionscontinueforabout8-10days.,64,Howisinvitrofertilizationperformed?4.Bloodandultrasoundtestingisdoneevery1-3daystomonitorthedevelopmentofthefollicles(egg-containingstructures)intheovaries.Weneedtogetaminimumnumberof3folliclestodeveloptomaturityinordertobeabletoproceedwiththeeggretrieval.About90%ofwomenunder40withanormalFSHandnormalantralfolliclecountswilldevelopatleastthisminimumnumberoffollicles.Ifthismanymaturefolliclescannotbeobtainedfromthestimulationprocess-wewillcancelthecycle(notproceedtoeggretrieval).,65,Howisinvitrofertilizationperformed?5.Whenthewomansfolliclesaremature,atransvaginalultrasound-guidedeggretrieval(eggaspiration)procedureisperformedtoremovetheeggsfromthefollicles.Theaveragedurationofthisprocedureis5-6minutes(atourfacility).6.Theembryosareculturedinthelaboratoryfor2-6days.7.Theembryotransferprocedureisdonewhichplacestheembryosinthewomansuteruswheretheywillhopefullyimplantanddeveloptoresultinalivebirth.ThisislikeaPapsmearforthewoman.Thereshouldbenodiscomfort.8.Ifthereareleftoverembryos(ofsufficientquality)beyondthenumberthatistransferred,manycouplesprefertohavethemfrozen(cryopreserved)foruseinafuturecycle.Embryocryopreservationcanbeusedforanotherattemptathavingababyifthefreshcyclefails-orasanattempttohaveanotherchildifthefreshcycleissuccessful.,66,Howisinvitrofertilizationperformed?5.Whenthewomansfolliclesaremature,atransvaginalultrasound-guidedeggretrieval(eggaspiration)procedureisperformedtoremovetheeggsfromthefollicles.Theaveragedurationofthisprocedureis5-6minutes(atourfacility).6.Theembryosareculturedinthelaboratoryfor2-6days.7.Theembryotransferprocedu