果酒中叶绿素铜钠的测定分光光度法

48生命科学仪器2008第6卷/1月刊研究简报果酒中叶绿素铜钠的测定分光光度法孔鲁裔（国家农业标准化监测与研究中心黑龙江）摘要研究各种操作条件对分光光度法测定果酒中叶绿素铜钠的影响,得到了较有价值的结论。关键词叶绿酸铜钠；果酒；分光光度法1前言叶绿酸铜钠是用有机溶剂从蚕沙或绿色植物的叶茎中提取的叶绿素，再经皂化、铜代所得到的墨绿色粉末，是一种半天然色素。在医药、食品及日用工业上有广泛的用途，可在食品加工中作罐头青豆、苦瓜、蕨菜以及糖果、蜜饯、饮料、酒等的着色剂。大量食用会造成人体重金属铜中毒、心血管等疾病。我国食品添加剂卫生标准（GB276096）中规定叶绿素铜钠盐在食品中最大使用量为05G/KG，有了规定的限量，没有定量的方法作正确的检测也就无法监控。为了确保安全，建立一个高效、准确的测定叶绿素铜钠的方法是势在必行的。本方法是目前对于果酒中叶绿素铜钠的检测最直接的方法。叶绿素铜钠的分析方法国外报道的有溶剂抽提法、氧化铝柱、聚酰胺薄层分析法等。但是，柱法操作复杂、时间长，难以避免色素分解、褪色。因此，本方法立足于运用常规的化学检测方法，采用了聚酰胺吸附法经过系统改进，试验得到了快速、简易、良好的效果。2检测方法21试剂与仪器211试剂与材料A）聚酰胺粉，80目120目。B）无水甲醇、冰乙酸、氢氧化钠、乙酸铵，均为分析纯。C）01MOL/L氢氧化钠溶液称取0400G氢氧化钠至100ML容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，于试剂瓶中保存。D）4MOL/L氢氧化钠溶液称取160G氢氧化钠，至100ML容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，于试剂瓶中保存。E）02MOL/L乙酸铵缓冲液称取7708G乙酸铵，至500ML容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，于棕色试剂瓶中保存。F）解吸液01MOL/L氢氧化钠无水甲醇溶液110（V/V）。G）叶绿素铜钠标准品997H）标准储备溶液精确称取按其纯度折算为100质量的叶绿素铜钠标准品00500G，于100ML棕色容量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，此溶液浓度为500G/ML，需当天配置。212仪器设备A）紫外可见分光光度计。B）砂芯漏斗G3。C）溶剂过滤器。22操作步骤221标准曲线的制备与测定2211标准工作溶液的配制精确移取500G/ML标准溶液10ML至100ML烧杯中，加入02MOL/L的乙酸铵溶液30ML，用冰乙酸调PH至56。加入30G聚酰胺粉，充分搅拌2MIN，避光静置5MIN，用G3砂芯漏斗抽滤。再用约200ML蒸馏水充分洗涤，弃去滤液。用75ML解吸液分三次解吸色素，每次倒入约25ML解吸液，浸泡2MIN，再摇匀2MIN，抽滤并用10ML解吸液洗净抽滤瓶中残液。收集滤液，用解吸液定容至100ML，配制成浓度为50G/ML的标准溶液，此溶液临用时配制。2212标准系列的配制及测定分别吸取标准工作液0ML、50ML、100ML、300ML、500ML，至50ML容量瓶中，用解吸液稀释至刻度，配制成浓度为0G/ML、5G/ML、10G/ML、30G/ML、50G/ML的标准系列。以0G/ML溶液为空白，用分光光度计以1厘米比色杯于404NM波长下测定其吸光值。222样品制备将样品摇匀，准确称取1000G2000G样品至49生命科学仪器2008第6卷/1月刊研究简报100ML烧杯中,加入02MOL/L的乙酸铵溶液30ML,在5560的水浴中加热3MIN5MIN。用氢氧化钠溶液和冰乙酸调PH至56。预先称取30G聚酰铵粉于小烧杯中，加蒸馏水调成浆状，加入样品中，充分搅拌。将样品溶液转移至G3砂芯漏斗中，抽滤，用约200ML蒸馏水充分洗涤，弃去滤液。用75ML解吸液分三次解吸色素（同2211），收集滤液，用解吸液定容至50ML。223样品测定取以上样品的制备液，以标准曲线的0G/ML溶液为空白，用分光光度计以1厘米比色杯于404NM波长下测定其吸光值。23结果计算样品中叶绿素铜钠的含量（G/KG）按式（1）计算（1）式中C样品中叶绿素铜钠的含量，G/KG；CI从标准曲线上查得的叶绿素铜钠盐的含量，G/ML；V样品定容体积，ML；M称取样品重量，G。计算结果保留到小数点后两位。3方法的主要技术研究过程31对叶绿素铜钠提取工艺的研究叶绿素铜纳是用有机溶剂从蚕沙中提取叶绿素，再经皂化、铜代所得的墨绿色粉状品，是一种半天然色素。叶绿素铜钠纯品，呈弱碱性易溶于水，略溶于醇和氯仿。在食品加工中做罐头青豆，苦瓜以及糖果、蜜饯、饮料、酒等的着色剂。32光谱扫描对叶绿素铜钠标准品进行紫外光谱分析扫描测其最大吸收峰为404NM，如图1。33聚酰胺粉吸附叶绿素铜钠最佳PH值范围的选择根据资料显示，聚酰胺粉在酸性条件下吸附性最好，而在试验中却发现叶绿素铜钠在酸性条件下，生成叶绿酸沉淀。为了选择最佳PH值范围，我们选用PH1、2、3、4、5、55、6、7、95的缓冲溶液各30ML，分别加入500G/ML的叶绿素铜钠标准溶液10ML和30G聚酰胺粉，经吸附后用100ML氢氧化钠甲醇解吸液解吸，目测情况如表1。结果表明，PH5060时无明显沉淀，吸附较完全，解吸附完全；中性条件下吸附与解吸最好。34吸附剂用量的选择分别吸取500G/ML的叶绿素铜钠标准溶液10ML于6个100ML烧杯中，加入02MOL/L的乙酸铵溶液30ML后用冰乙酸调PH至56。分别加入的05、10、20、30、40、50G聚酰胺粉，制备与测定过程同（221），并计算其回收率，如表2。结果表明，用30G聚酰胺粉吸附叶绿素铜钠，回收率在90以上效果最好。35解吸溶剂的选择351叶绿素铜钠盐在不同溶剂中的吸收情况吸取500G/ML的叶绿素铜钠标准溶液1ML于3个50ML容量瓶中，分别加入02MOL/L的乙酸铵溶液（PH7）、01MOL/L的氢氧化铵氯化铵溶液（110；PH10）及01MOL/L氢氧化钠无水甲醇溶液（110；PH11）定容至刻度，用分光光度计以1厘50生命科学仪器2008第6卷/1月刊研究简报米比色杯于404NM波长下测定其吸光值，如下表3。结果表明，在相同条件下叶绿素铜钠盐在01MOL/L氢氧化钠无水甲醇（110；PH11）溶剂中的吸光值最大测定灵敏度最高。352叶绿素铜钠盐在其它不同解吸液中的解吸附情况分别吸取500G/ML的叶绿素铜钠标准，溶液10ML于3个100ML烧杯中，吸附过程同（221），分别用下列三种解吸液分数次解吸色素，并分别收集滤液，用上述解吸液各自定容至100ML，于404NM下用1CM比色杯测定其吸光值，并计算其回收率，如表4。结果表明，前两种解吸液都可使用，第三种解吸液滤液混浊，影响比色。所以经综合考虑，本方法选用第一种解吸液。36对试验方法中标准品的标准曲线及线性关系进行研究配置不同浓度的标准溶液进行测定（同221），画出不同浓度范围内的标准曲线并计算其相关系数，如表5、图2。结果表明，以吸光值为纵坐标，叶绿素铜钠标准品含量为横坐标对其进行线性回归分析。回归方程为Y0034X00131，相关系数为R209997。37对方法进行重现性、精密度和准确度的测试表1目测吸附情况PH缓冲液吸附情况解吸附情况10盐酸乙酸钠有明显的沉淀,上层液混浊,带绿色20盐酸乙酸钠有沉淀,上层液混浊,略带淡绿色30盐酸乙酸钠有沉淀,上层液混浊,无色40盐酸乙酸钠有沉淀,上层液混浊,无色50盐酸乙酸钠无明显沉淀,上层液较澄清,略带淡绿色洗脱色素较快,聚酰胺层无色55盐酸乙酸钠无明显沉淀,上层液较澄清,略带淡绿色洗脱色素较快,聚酰胺层无色60盐酸乙酸钠无明显沉淀,上层液较澄清,无色洗脱色素较快,聚酰胺层无色70乙酸铵无沉淀,上层液澄清,无色洗脱色素较慢,聚酰胺层无色95氢氧化铵氯化铵无沉淀,上层液澄清,略带淡绿色洗脱色素不完全,聚酰胺层略带淡绿色表2吸附剂用量对回收率的影响吸附剂用量G051020304050测定浓度G/ML95844007341637451174474943546回收率791780158327902389508709表3在不同溶剂中的吸收情况波长02MOL/L乙酸铵溶液的吸01MOL/L氢氧化铵氯化铵01MOL/L氢氧化钠无水甲醇光值溶液的吸光值溶液的吸光值404NM049109920675解吸液回收率01MOL/L氢氧化钠无水甲醇溶液931MOL/L氢氧化钠无水甲醇溶液9301MOL/L氢氧化钠无水丙醇溶液滤液混浊无法测定表4其它不同解吸液中的解吸附情况表5标准曲线系列方程及相关系数浓度G/ML吸光值回归方程相关系数5000001821Y0034X00131R0999710000035863000010587500001698751生命科学仪器2008第6卷/1月刊研究简报序号测定吸光值测定浓度，G/ML平均值，G/ML标准偏差，相对标准偏差，1085962500125003000300122085982500830859625001408597250045085962500160859625001表6方法重现性和精密度的测试表7方法的准确度计算序号测定吸光值测定浓度平均值真实值绝对误差相对误差G/MLG/MLG/MLG/ML108596250012500325000000300122085982500830859625001408597250045085962500160859625001表8样品含量及重现性的测试名称序号测定吸光值测定浓度，G/ML样品称样量，G测定样品含量，G/KG平均值，G/KG青苹果酒10091927128M11000001360013720091226898001343009212716900136400945278770013950094327810001396009432783300139青葡萄酒70231462165M21000003110031380232062324003129023296257100313100233462708003141102334627040031412023206232400312样品名称平均值，G/KG标准偏差，相对标准偏差，青苹果酒001370000215000青葡萄酒003130000103195表9样品精密度的测试52生命科学仪器2008第6卷/1月刊表10样品的准确度计算样品名称序号测定值，G/KG平均值，G/KG绝对误差，G/ML相对误差，青苹果酒10013600137000010729520013400003219003001360000107295400139000021459950013900002145996001390000214599青葡萄酒700311003130000206390800312000010319590031300100031400001031951100314000010319512003120000103195表11样品第一次加标的回收率计算样品名称样品平均值样品的加标量测定的加标量样品回收率，G/KGG/KG平均值，G/KG青苹果酒00137加入050ML500G/ML002591036的标准溶液于1000G样品中，T100250G/KG青葡萄酒00313加入050ML500G/ML00244976的标准溶液于1000G样品中，T200250G/KG表12样品第二次加标的回收率计算样品名称样品平均值样品的加标量测定的加标样品回收率，G/KGG/KG量平均值，G/KG青苹果酒00137加入100ML500G/ML005131026标准溶液于1000G样品中，T100500G/KG青葡萄酒00313加入100ML500G/ML005311062标准溶液于1000G样品中，T200500G/KG表13方法检出限的测定稀释倍数标准溶液含量G/KG测定浓度，G/ML回收率，稀释10倍0002500502110042稀释20倍0001250250910036稀释25倍0001000203110155稀释30倍0000830133580100研究简报53生命科学仪器2008第6卷/1月刊37125G/ML叶绿素铜钠标准使用液的配制精确移取500G/ML叶绿素铜钠标准使用液5ML于100ML烧杯中，配制过程同（2211），配制成浓度为25G/ML的标准使用液。372方法重现性和精密度的测试分别配制6个25G/ML叶绿素铜钠标准使用液（重复配制过程同上371），分别以配制成的25G/ML的标准使用液为样品溶液，6个样液按上述条件，测定其浓度，计算标准偏差和相对标准偏差。结果表明，本方法重现性好，达到一定的精密度，如表6。373计算方法的准确度根据上述测定结果，已知6个样液配制浓度为25G/ML，计算测定值与真实值的绝对误差和相对误差。结果表明，本方法的准确度良好，如表7。38样品含量、样品重现性、精密度及准确度的测定381样品含量及样品重现性的测定选择有代表性的两种样品，用以上确定的外标法重复测定其叶绿素铜钠盐含量数次，求平均值，如表8。382计算样品标准偏差和相对标准偏差针对以上测得的数据，计算样品标准偏差和相对标准偏差。所得结果表明，本方法测定的样品重现性和精密度良好，如表9。383样品准确度的计算针对以上已知含量的样品进行多次测量，计算其准确度。所得结果表明，本方法测定的样品准确度良好，如表10。384样品的回收率测试；针对样品加入不同浓度的标准物质，按以上方法进行处理并测定其含量，计算回收率，结果表明样品均能达到一定的回收率如表11、12。39方法检出限的测定将标准曲线中的5G/ML的标准溶液，逐级稀释，测定本标准检出限为0001G/KG，如表13。4讨论聚酰胺粉吸附色素时，如果PH太低，叶绿素铜钠盐要生成叶绿酸沉淀，太高时吸附又不完全，试验证明在PH657范围内，色素既不沉淀，吸附又不完全。样品制备时，由于样品本身含有天然叶绿素，但经发酵和高温杀菌后色泽变黄，不被聚酰胺所吸附，所以在抽滤洗涤时要用蒸馏水充分洗涤干净后才能进行解吸，否则影响测定结果。解吸色素时，加入解吸液后，要让其与聚酰胺吸附层有充分作用的时间，然后再抽滤，直至色素全部解吸完，否则解吸液用量太多，超过定容体积，而且也不易完全。在加热驱除