猪皮胶原蛋白水解产物中的抗氧化活性肽的分离及其氨基酸组分

天然产物研究与开发NATPRODRESDEV2009,211222124,182文章编号10012688020090120122204收稿日期2007210219接受日期2007212229基金项目上海市食品研究所项目基金技042523通讯作者E2MAILPGZHOUSHFUEDUCN猪皮胶原蛋白水解产物中的抗氧化活性肽的分离及其氨基酸组分朱夕波,周培根3,李燕,张艳上海水产大学食品学院,上海200090摘要利用不同蛋白酶水解猪皮胶原蛋白,根据水解产物对自由基的清除率,筛选最适蛋白酶的组合,筛选抗氧化活性较高的肽类,并进行氨基酸分析。结果表明胃蛋白酶木瓜蛋白酶菠萝蛋白酶为酶解胶原蛋白的最佳组合分离纯化得到了三种具有较高抗氧化活性的肽氨基酸组分分析显示P1、P2和P3组分具有自由基清除作用的关键氨基酸甲硫氨酸、酪氨酸和组氨酸等。关键词胶原蛋白水解多肽抗氧化活性氨基酸中图分类号R28271/7705TS251文献标识码ASEPARATIONOFANTIOXIDATIVEPEPTIDESFROMPORCINECOLLAGENHYDROLYSISANDITSANALYSISOFAMINOACIDCOMPOSITIONZHUXI2BO,ZHOUPEI2GEN3,LIYAN,ZHANGYANCOLLEGEOFFOODSCIENCE,SHANGHAIFISHERIESUNIVERSITY,SHANGHAI200090,CHINAABSTRACTTHECOMBINATIONOFTHEDIFFERENTPROTEASES,USEDFORHYDROLYZINGOFTHEPORCINECOLLAGEN,ANDTHEANTIOXIDATIVEPEPTIDESWERESELECTEDFROMHYDROLYSATESBASEDONTHESCAVENGINGEFFECTOFTHEFREERADICALDPPH,ANDTHEIRAMINOACIDCOMPOSITIONOFTHEPEPTIDESWASANALYZEDTHERESULTSSHOWEDTHATTHECOMBINATIONOFPEPSIN,PAPAINANDBROMELAINWASOPTIMUMFORHYDROLYSISOFTHECOLLAGEN,ANDTHREEKINDSOFTHEANTIOXIDATIVEPEPTIDESWEREPURIFIEDTHEASSAYOFTHEIRAMI2NOACIDCOMPOSITIONSINDICATEDTHATTHEYCONTAINEDTHEKEYAMINOACIDFORTHEANTIOXIDATION,SUCHASMET,LYR,HIS,ETALKEYWORDSCOLLAGENHYDROLYSISPEPTIDEANTIOXIDATIONAMINOACIDANALYSIS胶原蛋白是构成胶原纤维、弹性纤维和网状纤维的蛋白质,是动物结缔组织的主要成分之一1,2。近年来猪皮胶原蛋白做为功能性成分在食品、化妆品中得到广泛使用。胶原蛋白经酶解后得到的生物活性多肽更有利于人体的吸收及利用3。LIB等报道猪皮胶原蛋白水解后的肽类具抗氧化性,他们清除自由基的活性主要由于TRP、TYR、MET和HIS存在4。本研究采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等蛋白酶水解猪皮胶原蛋白,以获得具有抗氧化的活性肽,并对其氨基酸组成进行分析。1材料与方法11材料与仪器猪皮购自上海市农贸市场,冷冻保存备用。胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶SIGMA公司,1,12二苯基苦基苯肼1,12DIPHENYL222PICRYL2HYDRAZYL,DPPH、东京化成工业株式会社,SEPHADEXG275和SEPHADEXG225PHARMACIA公司,其它试剂均为国产分析纯。数显恒温水浴锅HH22紫外可见分光光度计WFE2UV22000CHRIST冷冻干燥机快速蛋白液相色谱仪FPLC,AKTA公司氨基酸自动分析仪L28800AAA,日本日立。12方法121猪皮胶原蛋白的制备5,6将冷冻猪皮去脂、剪成小块,用PH75的磷酸盐缓冲液清洗干净后浸泡在01MOL/L的NAOH溶液中让其充分溶胀3D,然后用双蒸水清洗至中性,加入1W/W的胃蛋白酶在4,PH3的条件下限制性酶解24H,离心取上清液,经透析后冷冻干燥得到猪皮胶原蛋白。122蛋白酶组合的选择将蛋白酶的酶解顺序分为三组第一组为胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶第二组为胃蛋白酶和胰蛋白酶第三组为胃蛋白酶和菠萝蛋白酶。将25G胶原蛋白溶于50ML双蒸水中,90下预热5MIN使其解聚,然后按上述酶解顺序分别在最适条件下进行酶解。胃蛋白酶的作用温度为37,PH20,作用时间为5H木瓜蛋白酶的作用温度为55,PH70,作用时间为5H菠萝蛋白酶的作用温度为45,PH45,作用时间为4H胰蛋白酶作用温度为50,PH87,作用时间为8H。酶解完毕后,利用DPPH清除自由基法测定各组酶解产物的抗氧化活性,以确定最适蛋白酶组合。123抗氧化活性的检测729采用DPPH法测定抗氧化活性,分别吸取2ML待测溶液和DPPH的无水乙醇溶液置于试管中,摇匀,在室温下反应30MIN后在波长517NM处测定吸光度AI分别吸取2MLDPPH无水乙醇溶液与无水乙醇于试管中,摇匀,在室温下反应30MIN后在517NM处测定吸光度AC最后分别吸取2ML待测液和无水乙醇于试管中,摇匀,在室温下反应30MIN后在517NM处测定吸光度AJ。采用下列公式计算DPPH抑制率抑制率1AIAJ/AC100124抗氧化肽的分离与纯化将5G胶原蛋白溶于100ML双蒸水,90下预热5MIN,采用最适蛋白酶组合依次进行酶解,用1MOL/L的HCL和NAOH将其调至最适作用PH值,并在最适温度下进行水解,当水解完成后沸水浴5MIN以终止反应,在4下,10000R/MIN离心除去沉淀,取上清液进行SEPHADEXG22516400410MM柱层析,用经超声脱气后的双蒸水作为流动相进行洗脱,流速为5ML/MIN,检测波长为280NM收集出现蛋白质峰的洗脱液,冷冻干燥得到多肽样品。最后,将该样品溶解在少量的双蒸水中,进行SEPHADEXG27510300310MM柱层析,流速为1ML/MIN,其它操作步骤同上。125氨基酸组分分析10经上述纯化后的抗氧化活性肽组分,用6MOL/L的HCL在110下水解24H。将水解液全部转移至旋转蒸发仪内蒸干,用01MOL/L的HCL溶解并调节氨基酸浓度在04210NMOL/L。采用氨酸酸自动分析仪进行氨基酸组分分析。2结果与分析21最适蛋白酶组合的确定图1表示三种不同蛋白酶组合酶解产物对DP2PH的清除效果,从图中可以看出,第一组酶组合的酶解产物对DPPH的清除率最强,第二组最低据图可知存在胰蛋白酶组合的酶解产物对DPPH的清除率明显较低,而存在木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶时清除率相对较高。因为胃蛋白酶水解疏水侧链,特别是芳香族氨基酸PHE、TYR和TRP木瓜蛋白酶作用位点非常宽,先水解ARG,其次是LYS、GLY、ALA、LEU、GLU、ASP、HIS、SER等菠萝蛋白酶水解TYR、LYS、ARG和PHE四种氨基酸而胰蛋白酶具有很强的专一性,只水解ARG和LYS。根据文献4中BOLI等研究得到TRP、TYR、MET和HIS是具有自由基清除作用的四种关键氨基酸。所以加入胃蛋白酶酶解后,再加入木瓜蛋白酶酶解有利于抗氧化活性位点或基团的暴露,所以组合三的抗氧化活性较高在组合三的基础上再加入菠萝蛋白酶酶解则抗氧化活性位点或基团又进一步增加,因而组合一的抗氧化活性比组合三高组合二中的胰蛋白酶具有高度的专一性,不利于抗氧化活性位点或基团进一步暴露,因此抗氧化活性最低。因此,最终确定胃蛋白酶木瓜蛋白酶菠萝蛋白酶为最佳酶解组合。图1各酶组合水解物清除DPPH能力FIG11SCAVENGINGDPPHABILITYOFHYDROLYSATES注第一组表示蛋白酶处理顺序是胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及菠萝蛋白酶第二组是胃蛋白酶和胰蛋白酶第三组是胃蛋白酶和菠萝蛋白酶。NOTETHEFIRSTCOMBINATIONISPEPSIN,PAPAINANDBROMELAINTHESECONDISPEPSINANDTRYPSINTHETHIRDISPEPSINANDBROMELAIN22抗氧化活性肽的分离及纯化经过上述最适蛋白酶组合酶解猪皮胶原蛋白的酶解产物SEPHADEXG225柱层析的结果见图2,从图中可以看出,在波长280NM处有两个蛋白峰,分别以P1和P2表示,它们对DPPH自由基的清除率的测定结果见图3,从图中可以看出,抗氧化活性主要集中在P2组分。经冷冻干燥后的P2组分溶于少量双蒸水中,然后进行SEPHADEXG275柱层析以进一步纯化,结果见图4。从图4可以看出,P2组分是由3种蛋白组分321VOL121朱夕波等猪皮胶原蛋白水解产物中的抗氧化活性肽的分离及其氨基酸组分组成的混合物,分别以P1,P2和P3表示。它们对自由基清除率的测定结果见图5。从图中可以看出P1和P3组分的抗氧化活性相似,均高于P2组分。23抗氧化活性肽P3的理化性质根据表1我们发现P1、P2和P3组分中均含有甘氨酸,缬氨酸,苯丙氨酸,赖氨酸和组氨酸LIB等人在文献4中报道MET、TYR、PHE和HIS是四种有自由基清除效果的关键氨基酸,据表1可知在P2组分中仅含有HIS,且含量远比P1和P3组分低,P1和P3组分中则均含有MET,TYR和HIS三种氨基酸,且含量较高。因此进一步证明P1和P3组分比P2组分的抗氧化活性高。表1P1、P2和P3的氨基酸组分TABLE1AMINOACIDCOMPOSITIONOFP1,P2ANDP3FRACTIONS氨基酸种类KIND氨基酸含量CONTENTNG/100MGP1P2P3ASP1939261829213THR69957078SER193210700GLU476952432GLY1802010277524323VAL131793174209743MET38834877TYR428926463PHE229633982183113LYS18958132632439NH39649270710286HIS380213566236ARG257441663注3为必须氨基酸。NOTETHEAMINOACIDWITH3ARENECESSARY3结论利用不同蛋白酶水解猪皮胶原蛋白,根据水解产物对自由基的清除率,筛选得到最适蛋白酶组合为胃蛋白酶木瓜蛋白酶菠萝蛋白酶,其他依次是胃蛋白酶菠萝蛋白酶和胃蛋白酶胰蛋白酶分离纯化后得到了有较高抗氧化活性的肽氨基酸组分分析显示P1、P2和P3组分中均含有HIS,P1和P3组分中还含有MET和TYR两种具有自由基清除效果的氨基酸。因为构成肽的氨基酸种类、数量及排列顺序共同决定着肽的抗氧化性能,所以对P1、P2和P3组分的构效关系及其在体内的抗氧化机理仍需进一步研究。致谢感谢导师周培根和李燕老师在论文中的悉心指导和细致帮助感谢仪器、药品实验室党培育老师及师妹张艳的热心帮忙。参考文献1HONGCHAOZE鸿巢章二,QIAOBENZJ桥本周久UTILIZA2TIONOFAQUATICPRODUCTCHEMISTRY水产利用化学BEI2JINGCHINAAGRICPRESS,1994269下转第182页421天然产物研究与开发VOL121CODINGTHECOLLAGEN2BINDINGS2PROTEINOFLACTOBACILLUSCRISPA2TUSJCM5810INLACTOBACILLUSCASEIATCC393TJBACTERIOL,2000,18268572686124JAKAVA2VILJANENM,AVALL2JSKELINENS,MESSNERP,ETALI2SOLATIONOFTHREENEWSURFACELAYERPROTEINGENESSLPFROMLACTOBACILLUSBREVISATCC14869ANDCHARACTERIZATIONOFTHECHANGEINTHEIREXPRESSIONUNDERAERATEDANDANAEROBICCON2DITIONSJBACTERIOL,2002,184678629525AVALL2JSKELINENS,LINDHOLMA,PALVAASURFACEDISPLAYOFTHERECEPTOR2BINDINGREGIONOFTHELACTOBACILLUBREVISS2LAY2ERPROTEININLACTOCOCCUSLACTISPROVIDESNONADHESIVELACTO2COCCIWITHTHEABILITYTOADHERETOINTESTINALEPITHELIALCELLSAPPLENVIRONMICROBIOL,2003,6922302223626WALLT,ROOSS,JACOBSSONK,ROSANDERA,ETALPHAGEDIS2PLAYREVEALS52NOVELEXTRACELLULARANDTRANSMEMBRANEPRO2TEINSFROMLACTOBACILLUSREUTERIDSM20016TMICROBIOL,2003,14934932350527LEESY,CHOIJH,XUZMICROBIALCELL2SURFACEDISPLAYTRENDSBIOTECHNOL,2003,214525228BUCKBL,ALTERMANNE,SVINGERUDT,ETALFUNCTIONALANALY2SISOFPUTATIVEADHESIONFACTORSINLACTOBACILLUSACIDOPHILUSNCFMAPPLENVIRONMICROBIOL,2005,718344251上接第124页2MONTEROP,GOMEZ2GUILLENMEXTRACTINGCONDITIONSFORME2GRIMLEPIDORHOMBUSBOSEIISKINCOLLAGENAFFECTSFUNCTIONALPROPERTIESOFTHERESULTINGGELATINFOODCHEMTOXIC,2000,6543424383CAESSENSPW,VISSERS2LACTOGLOBULINHYDROLYSISPEPTIDECOMPOSITIONANDFUNCTIONALPROPERTIESOFHYDROLYSATESOB2TAINEDBYACTIONOFPLASMIN,TRYPSIN,ANDSTAPHYLOCOCCUSAU2REUSV8PROTEASEJAGRICFOODCHEM,1999,472973229794LIB,CHENF,WANGX,ETALISOLATIONANDIDENTIFICATIONOFANTIOXIDATIVEPEPTIDESFROMPORCINECOLLAGENHYDROLYSATEBYCONSECUTIVECHROMATOGRAPHYANDELECTROSPRAYIONIZATION2MASSSPECTROMETRYFOODCHEM,2007,1021135211435LANWQ蓝蔚青,LIY李燕,ZHOUPG周培根PRI2MARYSTUDYONTHEEXTRACTIONANDUTILIZATIONOFCOLLAGENFROMPORKSKINJMEATRES肉类研究,2006,3442486WUWH吴文惠,ZHUXB朱夕波,BAOB包斌,ETALSTUDYOFTHECHARACTERIZATIONANDISOLATIONOFCOLLAGENFROMBLUESHARKSCALPCHINJNAUTICALMEDHYPERBARICMED中国航海医学与高气压医学杂志,2007,1423022327LARRAURIJA,SANCHEZ2MORENOC,SAURA2CALIXTOFEFFECTOFTEMPERATUREONTHEFREERADICALSCAVENGINGCAPACITYOFEX2TRACTSFROMREDANDWHITEGRAPEPOMACEPEELSJAGRICFOODCHEM,1998,462694226978CHENHM,MURAMOTOK,YAMAUCHI,ETALANTIOXIDATIVEPROP2ERTIESOFHISTIDINE2CONTAININGPEPTIDESDESIGNEDFROMPEPTIDEFRAGMENTSFOUNDINTHEDIGESTOFASOYBEANPROTEINJAGRICFOODCHEM,1998,46492539LIY,ETALANTIOXIDANTANDFREERADICAL2SCAVENGINGACTIVITIESOFCHICKPEAPROTEINHYDROLYSATECPHFOODCHEM,2008,106444245010SENWOZN,TABATABAIMAAMINOACIDCOMPOSITIONOFSOILOR2GANICMATTERJBIOLFERTILSOIL,1998,262352242上接第128页9ADLER2NISSENJENZYMICHYDROLYSISOFFOODPROTEINLONDONELSEVIERAPPLIEDSCIENCEPUBLISHERS,1989,9165216610LIXD李晓东,NIUZX牛治霞,ZHANGBL张柏林VARIOUSMETHODSAVAILABLEFORTHEDETERMINATIONOFHYDROLYZEDDEGREEOFWHEYPROTEINCHINDAIRYINDUS中国乳品工业,2006,34105926211ZHANGLX张龙翔,ZHANGTF张庭芳,LIAY李爱媛THEBIOCHEMICALLABORATORIALMETHODANDTECHNOLOGY生化实验方法和技术BEIJINGTHEHIGHEREDUCATIONPUBLISH2IONHOUSE,1984164216