毛细管电泳分离技术资料PPT课件

.,1,毛细管电泳分离技术,姓名：饶海英学号：20114209033,.,2,毛细管电泳分离技术,概述毛细管电泳基本原理毛细管电泳的分离模式影响毛细管电泳分离效率的因素毛细管电泳技术的应用21世纪毛细管电泳发展趋势,.,3,一、概述,毛细管电泳（capillaryelectrophoresis，CE），又称高效毛细管电泳（HPCE）是近年来发展最快的分析化学研究领域之一。是基于两种或多种带电粒子或微粒，它们所在的介质受到外加直流电场的作用下，其迁移速率不同而得到分离的一类方法。,.,4,二、毛细管电泳基本原理,CE是以高压电场为驱动力。以毛细管为分离通道，依据样品中各组成之间淌度和分配行为上的差异，而实现分离的一类液相分离技术。仪器装置包括高压电源、毛细管、柱上检测器和供毛细管两端插入又和电源相连的两个缓冲液贮瓶，在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称电泳。,.,5,毛细管电泳装置,直流高压电源、毛细管、进样装置、检测器和记录仪等,.,6,高压电源可对毛细管施加550kV电压，操作电压一般控制在530kV范围。CE通常使用内径10100m、长12120cm(内涂聚酰亚胺)弹性融凝石英毛细管，毛细管的两端分别浸泡在含有缓冲溶液的贮液槽中，毛细管内也充满同样的缓冲溶液。被分离试样可以采用流体动力学进样和电动进样方式由毛细管一端进入。,.,7,毛细管电泳的进样技术,毛细管内径小于100m时，注射器进样比较困难。（一）电动进样（二）流体动力学进样,.,8,（一）电动进样,三步：毛细管的进样端插入装有试样溶液的试样管中，试样管中插入电极，与检测段的缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间，试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管，然后再将试样溶液换成缓冲液，电泳即可进行。改变进样电压和进样时间，便可改变进样量。,.,9,（二）流体动力学进样,流体动力学进样：也称虹吸进样、重力进样和压差进样。将毛细管插入试样溶液容器，通过进样端加压，或调节进样端试样溶液液面高于出口端缓冲液液面高度，利用虹吸现象，试样在压力差作用下进入毛细管进样端，再把进样端放回缓冲液液槽中，进行电泳。,.,10,毛细管电泳检测器,由于样品区带在高压电场作用下，迁移速度较快，因此，CE要求所用的检测器必须具有很快的响应速度和很高的灵敏度。常用的检测器有：光学检测器（紫外检测器和荧光检测器）电化学检测器质谱检测器核磁共振检测器,.,11,紫外检测器,根据比耳定律，光度测量值A与吸收光呈成正比。一般检测中，检测最大光程是用毛细管内径，而毛细管内径增大受焦耳热影响的制约，因此采用细内径毛细管柱时，测量灵敏度受到限制。,.,12,三、毛细管电泳的分离模式,毛细管区带电泳(CZE)胶束电动毛细管电泳(MECC)毛细管凝胶电泳(CGE)毛细管等电聚焦(CIEF)毛细管等速电泳(CITP)毛细管离子电泳(CIE)毛细管电色谱,.,13,四、影响毛细管电泳分离效率的因素,从毛细管电泳的效能（塔板数、塔板高度）及分辨率的关系式可以看出，影响毛细管电泳与分离效率的因素很多，下面就几个主要方面加以简要分析：峰拓宽电渗流的控制介质条件,.,14,峰拓宽,用2表示峰宽总方差，如半峰宽仅由溶质的扩散所引的，则2=2DL。因此任何影响扩散系数D的因素，都会影响峰宽。但实际上，其它因素如进样、焦耳热产生的温度分布、电渗等都会对带宽产生明显的影响。进样会产生自然宽度，它与进样“塞”的长度及初始形状有关，为了减少进样增宽，导入的样品“塞”应为矩形，进样长度一般小于毛细管分离长度的1%；电流通过毛细管内缓冲溶液时，产生焦耳热，使温度发生变化，将引起溶液粘度的变化及电泳、电渗性能的变化。引起温度变化的原因是电流强度，电流增大时，管内溶液温度升高，管中心与管壁的温差T可达几十度，在毛细管内形成径向的温度梯度，溶质在电场中的迁移速度也在管径内形成梯度，严重影响分离效果。为了消除其影响，须将I控制在200A以下，使用薄壁及内径小的毛细管，并在恒温下进行电泳。,.,15,电渗流的控制,管壁的Zeta电位()是产生电渗流的主要因素。电渗流的大小，可采用以下措施加以控制：对毛细管内壁进行适当的化学修饰，在管内壁键合上一层中性材料可减少电渗流，同时也可减少溶质与管壁的相互作用，减少溶质吸附于管壁上。这对于蛋白质类的生物大分子的分离尤为重要。调节缓冲液的pH值及缓冲液的浓度。降低缓冲液的浓度，可降低电流强度，减少管内壁溶液的温度差。加入表面活性剂(如环糊精)或手性试剂。加入适量的有机溶剂也可以降低电渗流。,.,16,介质条件,介质条件除缓冲溶液及pH值等条件外，为了提高分离的选择性，常常在缓冲液中添加适量的表面活性剂，或者使用非水溶剂。基于环糊精(CD)的分子结构具有圆锥形的空腔、可以形成“包络物”的特性，在胶束电动毛细管色谱分离法(MECC)中，常在含有十二烷基硫酸钠(SDS)胶束的电泳缓冲液中，加入一定浓度的环糊精，使待分离的组分在水相、SDS胶束相和环糊精中进行分配。由于不同溶质分子或荷电质点的分配不同，在电泳力和电渗力的驱动下，将以不同的速度在毛细管中迁移，以获得更好的分离效果。,.,17,五、毛细管电泳技术的应用,（一）糖类的分离与分析（二）在天然中草药分析领域中的应用（三）在基因工程研究方面的应用（四）单细胞分析（五）手性分离（六）小分子离子分析,.,18,.,19,对于已经发展了近20年的毛细管电泳技术来说，在新的世纪中，仍然面l临着极大的机遇和挑战。仪器的发展需要进一步成熟和完善在重现性、速度和检测灵敏度等方面还期待着重大突破。多种检测手段的可供选择，在众多革新应用中。MS会在多种应用领域中成为更重要和更标准的检测方法。微全分析(pTAS)的提出，使得集成毛细管电泳技术(ICEC)延伸了毛细管电泳的潜力和可行性。随着人类基因计划的重