第三章--基因组的结构和功能

第三章基因组的结构和功能基因（gene）是核酸的中贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列（P27）。从生化学上来说指的是一段DNA或RNA（病毒）顺序，该顺序可以产生或影响某种表型，可以由于突变生成等位基因变异体。从遗传学上来说代表1个遗传单位、1个功能单位、1个交换单位或1个突变单位。,表型和基因型某一机体可以观察到的特征称为表型（phenotype），与表型相应的基因组成称为基因型（genotype）。如细菌能否合成亮氨酸记为Leu+和Leu-，相应的基因型为Leu+和Leu-。等位基因（1）二倍体细胞有2套基因，一套来自父本，另一套来自母本，每个细胞的全部基因均由2套基因组成，每一对基因称做等位基因。（2）由于突变作用引起DNA结构变异，所以某一基因可具有若干种不同的形式，这种同一基因不同的形式互称等信基因（allele）。,基因的基本结构5、AGCCGACTATGTCGAAGCTT、GCTTGACTATAAGACA、33、TCGGCTGATACAGCTTCTAA、CGAACTGATATTCTGT、5转录调控区贮存RNA或蛋白质结构信息区转录终止区,基因组（gencme）细胞或生物中，一套完整单倍体遗传特质的总和（包括一种生物所需的全套基因及间隔序列）称为基因组（P27）。基因组的结构主要指不同的基因功能区域在核酸分列中的分布和排布情况，基因组的功能是贮存和表达遗传信息。人类基因组包含多染色体和XY两条性染色体上的全部遗传物质（核基因组）以及胞线粒体上的遗传物质（线粒体基因组）。（X免疫基因，男XY，女XX）。*1个配对（精子或卵子），1个单倍体细胞或1个病毒所包含的全套基因，称为基因组。,第一节原核基因组Prokaryoticgenome以细菌为代表讲述，有称bacteriagenome。细菌对医学分子生物学有重要贡献，是基因工程研究的主要材料之一。因为：1.构造相对简单，基因结构也不复杂，取材便利，易于培养，可选择突变株进行研究，实验结果容易重复。（如选择DDDPI缺乏的Ecoli突变株，Ecoli仍可合成DNA，说明酸I对EcoliDNA合成不起作用。）2.与人类有共同的要子生物学规律可，如：（1）遗传物质都是DNA；（2）主要的功能分子都是蛋白质；（3）基因密码是通用的，等等。3.尤其是E.coli,是分子克隆是“明星“,基因工程主要原因的工程菌，因为基因工程的主要工作是克隆克核基因在原核系统中表达。,一、原核生物基因组结构与功能的特点1.基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。其DNA是与蛋白质结合，但并不形成染色体结构，只是习惯上将之称为染色体。细菌染色体DNA在胞内形成一个致密区域，即类核（nucleoid），类核无核膜将之与胞浆分开。2.基因组中只有1个复制起点。3.具有操纵子结构。操纵子（operon）是指数个功能相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动和操纵区）及其下游的转录终止信号构成的基因表达单位。（见第六章）4.结构基因无重叠现象，基因组中任何一段DNA不会用于编码2种蛋白质。5.基因序列是连续的，无内含子结构。,6.编码区和非编码区（主要是调控序列）在基因组中约各占50%。（5%，95%）7.基因组中的重复序列很少。编码蛋白质结构基因多为单拷贝，但编码rRNA的基因往往是多拷贝的，这有利于核糖体的快速组装。（15AA/秒，2AA/秒）8.具有编码同功酶的基因（isogene）这是一类结构不完全相同，而功能相同的基因。如E.coli含有2个编码乙酸乳酸合成酶的基因和2个编码分支酸变位酶同工酶的基因。9.细菌基因组中存在可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子。10.原核基因的基本结构特点：启动子（promoter）、操纵基因（operator）、调控序列、结构基因（structuregene）、终止子（terminator）。（见第六章）,二、染色体外的遗传物质质粒（一）概念1.质粒（plasmid）是独立于许多细菌及某些真核细胞染色体外共价闭合环状的DNA分子（covalantclosedcircnlar,cccDNA），能独立复制的最小遗传单位。（P35-6）2.质粒是双链的DNA分子，大小在1200kb之间，和病毒不同，它们没有衣壳蛋白（裸DNA）。,从生化学来说，除酵母的杀伤质粒（killerplasmid）是RNA外，其余质粒是染色体外的cccDNA分子。从遗传学来说，质粒是与宿主染色体有别的复制子（真核细胞分裂过程中，DNA纤维分成许多复制单位，该单位称为复制子）。在细胞分裂时能恒定传递给交代细胞的独立遗传因子或能在胞内寄生和复制的复制子。,3.质粒与宿主细胞的关系（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。（2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。（3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿主细胞的补偿（“交房租”）。（4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关的，如抗生素抗性基因：Ampr酶，水解-内酰胺环,解除氨关毒性,使细菌抗氨关。Tetr膜蛋白,可阻止四环素进入细胞,使细菌抗四环素。,4.质粒发现和研究意义1）理论意义质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要基石。2）实践意义是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达（见第八章）。质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到外都是。,作为基因工程载体的3个特点：A.都能独立自主的复制；B.都能便利的加以检测（抗生素抗性）；C.都能容易引进宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化（提质粒）。质粒符合上述3个条件。基因工程中主要使用人工构建的质粒。,（二）质粒的分类1.按质粒的复制机理，分为2类：1）严谨控制型（stringentcontrdtype）2）松弛控制型（relaxedcontroltype）(1)拷贝数少，一般1052.中度重复序列在基因组中的重复次数为101-1053.单拷贝序列在整个基因组中出现1次或少数几次（100-101）。,（七）端粒（telommere）以线性染色体形式存在的真核基因组DNA的末端都有一种特殊的结构，称为端粒。（形式上膨大成粒状而得名）。结构1.是染色体末端DNA和蛋白质构成复合体。仅在真核细胞染色体末端存在。2.其DNA序列相当保守，一般由多个串联在一起的短寡核苷酸（5-86p）序列构成。3.碱基成分因种属而异，重复次数在不同生物中变化较大，如小鼠的端粒DNA达150kb,人类的端粒DNA约515kb。功能1.保护线性DNA的完整复制2.保护染色体末端及决定细胞的寿命等。,二.人类基因组中的重复顺序（一）反向重复顺序（invertedrepeats,IR）ATTAGCGCTAATATTAGCGGATGCTAATTAATCGCGATTATAATCGCCTACGATTA1.连续的反向重复顺序，这种结构又称回文结构（palindrome)，是指一段DNA顺序，在两条链上，正读与反读意义相同。2.不连续的反向重复顺序之间含有间隔顺序。1.2占人类基因组5%，可能与复制、转录调控有关。,（二）串联重复顺序（tandemrepeats）1.编码区串联重复顺序如组蛋白基因、5srRNA基因等。其意义在于快速大量合成相应基因的mRNA.2.非编码区串联重复顺序通常存在于间隔DNA*和内含子内，是组成卫得DNA*的基础。卫星DNA可分为三类，大卫星DNA、小卫星DNA和微卫星DNA。,*间隔DNA(spacerDNA)真核基因组中，在基因之间也有一些非编码顺序将它们隔开，一般称为间隔DNA，是和内含子性质不同的插入顺序。*卫星DNA（satelliteDNAsat-DNA）又称随体DNA。这部分DNA是在用cscl密度梯度离心时发现的。,大肠杆菌DNA剪切成若干片段后离心只得到1个峰，而蟹DNA在主峰旁边还有1个小峰，其中所含DAN称sat-DNA.Sat-DNA的A+T/G+C比值不同于主峰DNA的比值，因而其密度也不同于主峰DNA。比值改变原因是它们含有大量的重复顺序而使某段DNA分子（A+T）或（G+C）偏低或偏高。（下图因比值远远大于主峰DNA，导致密度较低所致）。,（三）散在重复顺序（intersprersedrepeats）散在重复顺序是人类基因组中非串联非反向的重复顺序，包括少数活跃的转位因子，根据重复序列的长度可将该家族分为2个主要类型，短散在核元件和长散在核元件。1.SINEs(shatinterspersednuclearelements)2.LINES(longinterspersednuclearelements)代表Alu家族(逆转录转座子)KpnI家族（1）序列中含Alu限制酶位点（1）序列中含Kpn限制酶位点（2）基因组中重复数3-5105（2）全长6-7kb（3）Alu顺序之间间隔:3-5kb（3）Knp消化后可见4条带（4）相对集中在染色体R带（4）集中分布在染色体G或Q带逆转来转座子RNA介导转座,合成cDNA基因组,三.人类基因组DNA多态性某一机体可以观察到的特征,称为表现(phenotype),与表型相应的基因组成称为基因型(genotype).人类个体之间所以表现为千差万别,其物质基础在于基因组DNA的差异.DNA序列的多态性就是这些差异中十分重要的1种,DNA序列多态性可分为位点的多态性和串联重复顺序多态性,前者又可造成限制性长段长度多态性.,(一)DNA位点多态性(DNAsitepolymorphism)DNA位点多态性是由于等位基因间在特定位点上DNA序列存在差异造成的.在各种DNA位点多态性系统中,HLA(人类白细胞抗原)是最复杂的一种.就其表型而言,从理论上来说,已远远超过了现有地球人口,人类为远交群体,因此要在无血缘关系人群找到HLA表型完全相同的个体几乎是不可能的.(见分子免疫学).,(二)限制性中段长度多态性(restictionfragmentlengthpolymorplism,RFLP)1.DNA位点的多态性可影响限制酶的切割位点，造成限制片段长度多态性，即用同一种限制酶消化不同个体DNA时，会得到长度各不相同的限片段类型。是DNA多态性的一种特别有用的形式，当DNA分子由于中性突变，使某种限制酶切点数增加，减少或移位，导致限制性片段长度发生改变（也称为RFLP），就会得到不同限制性片段类型，这样的位点称为多态性位点。,(三)重复顺序长度多态性1.小卫星DNA多态性很复杂，个体之间的差异极高。2.微卫星DNA多态性,功能不太清楚.(四)DNA位点的多态性可以作为遗传标记，用于基因诊断或个体鉴定，其与疾病的相关研究正在进行之中。,本节概要地介绍了对人类基因组研究和认识，但显然还有大量的未知，比如仅弄清楚了极有限的功能基因，一小部分基因序列，距离彻底了解人类自身遗传背景还很遥远。正是存在这种科学内在的驱动力，人类在20世纪末开始了的探索自身为主要目的的伟大科学计划人类基因组计划，其重要意义完全可以与原子弹计划和阿波罗登月计划相比。,第三节病毒基因组基因组（genome）1个配（精子或卵子），1个单倍体细胞或1个病毒所包含的全套基因。病毒核酸或为DNA或为RNA，可以统称为病毒染色体。完整的病毒颗粒具有蛋白质外壳，以保护病毒核酸不受核酸酶的破坏，并能识别和侵袭特定的宿主。类病毒例外，它是一类植物病毒，为很小的单链闭环RNA（250-400碱基）。,病毒核酸与所有的原、真核生物的核酸组比较，最为突出的特点是每种病毒颗粒只含1种核酸，或DNA或RNA，两者不共存于1种病毒颗粒中，据此，病毒可以分成两组，即DNA病毒和RNA病毒。病毒核酸分子量大小：RNA病毒小106-107D，DNA病毒大；107-108D基因数：3-几百个,一切烈性病毒（virulentvirus）都具备参下几个时相的生活周期：（1）吸附；（2）核酸进入细胞；（3）转录、翻译和复制；（4）病毒颗粒成熟；（5）释放病毒颗粒。典型的生活周期为6-48小时，噬菌体为20-60分钟。病毒对细胞功能的干予，最典型的是噬菌体（phage），当其入菌后，立即接管了细菌的各种主要功能，细菌自身的DNA复制RNA转录，蛋白质合成，能量代谢等都停顿下来转变成合成病毒的机器。有些动物病毒也有类似的情况，但非普通规律。相对而言，动物病毒和宿主细胞可以共存一段时间至病毒生活周期的后期才造成宿主细胞的严重损害，这些损害有如下3个类型：（1）抑制宿主RNA和DNA的合成。（2）核糖体合成受损。（3）蛋白质合成受抑制是普遍现象。与人类疾病有关的病毒属于动物病毒，它包括8个DNA病毒科和12个RNA病毒科，这些病毒基因组结构和功能已基本清楚（见分子病毒学HIV、没办法）。,（二）病毒有（十）链RNA和（一）链RNA之分。（十）RNA病毒（一）RNA概念极性和mRNA极性相同，与mRNA极性相反或与（十）RNA碱基顺序也相同。互补的RNA。作用1.作为模板（与mRNA一样）必须依赖翻译出病毒多肽或蛋白质。RNA的RNA2.作为模板，合成（一）RNA，pol合成（十）可以以（一）RNA为模板RNA（mRNA）合成子代病毒RNA。才能翻译出3.作为模板合成cDNA.病毒（即以mRNA为模板反转录合成DNA）。蛋白质。,二.病毒基因组结构功能特点（P28）（一）病毒核酸可以是ssDNA、dsDNA或RNA分子，分子结构有发夹、环状、线型、节段型。以SSDNA,dsRNA最为突出。（二）基因重叠即同一段基因可以编码2种或以上的基因产物这种现象在其它生物细胞仅见于线粒体和质体DNA.所以是病毒核酸较为独特结构能使小小病毒携带较多的遗传信息，原因是病毒基因阅读框可以错位（SV40）。,（三）连续的和不连续的基因病毒基因结构特征往往与其宿主细胞基因结构相似。原核病毒（如噬菌体）基因是连续的，没有内含子；真核病毒（如多瘤病毒）基因是不连续的，有内含子。有意思的是，有些真核病毒的内含子或其中的一部分对某一基因来说是内含子，对另一基因却是外显子。如SV40和多瘤病毒的早期区域就是这样的。除了（+）RNA病毒外，真核病毒基因都是先转成mRNA前体，再经过剪接等步骤能成为成熟的mRNA.,(四)节段性基因大部分病毒核酸都是由一条双链或单链构成，少数病毒核酸由数个片段构成。这类病毒一般度RNA病毒。如flu-v由6-7个片段构成，各段在天然状态下不连接，而且可以转录成6-7个片段相应的mRNA。单独的片段没有感染性，感染要一起感染才发挥作用。(五)除了retro-v外，所有的病毒基因都是单倍体基因。即每个基因在某个病毒颗粒中只出现一次，即只有1套基因。(六)编码区非编码区（95%/5%）。病毒核酸大多数顺序都用来编码蛋白质。,(七)基因常常成簇排列，没有间隔序列或间隔序列很小。功能相关蛋白质基因在基因组的1个或几个特定部位，丛集成簇被转录成多顺反子，然后加工成各种蛋白质的mRNA模板。如腺病毒晚期基因。(八)不规则的结构基因1.几个结构基因的编码区不规则，因此有些结构基因无翻译起始序列。2.有的mRNA（=gene）没有5帽子，但有翻译增强子。(九)DNA或RNA1种病毒基因组只是1种核酸。,三、典型病毒基因组（一）SV40病毒基因组SV40（simiansarcomavirus40猴肉瘤病毒)属乳多空病毒类，是最小的DNA病毒之一。它可长期潜伏于猴肾细胞，对新生仓鼠有致癌性，体外试验还可使多种属细胞恶性转化。,1、基因组结构特点（1）双链环状DNA分子、MW3103KD，长52436p,与4种组蛋白（H2A、H2B、H3及H4）综合，与真核染色质区别在于不含H1。（2）基因组由早期基因、调控区和晚期基因构成。早期基因含有2个重叠基因，编码T和t（T=tumor)抗原晚期基因含3个重叠基因，编码VP1（主），VP2和VP3（次）3种衣壳蛋白调控区位早、晚期基因之间，长约4006p包括复制起点，启动子和增强子，可调节基因组的复制及早、晚期基因的转录。,2、SV40病毒基因的表达（1）启动子位于调控区复制起点上游，其中含有RNApdII识别位点位于-21-26bp之间的TATA盒可启动RNA转录起始准确位置，一般不相差10个核苷酸。（2）增强子在106-250位是2个串联的含有72bp的完全重复顺序，即为增强子，能增强SV40及异源基因的表达。（3）早期基因转录的mRNA前体选择剪接形成不同的mRNA（TmRNA、t-mRNA),3、病毒基因组的复制及基因表达调控T抗原控制病毒的复制，启动晚期基因转录。（1）早期基因T及t的表达受T抗原的反馈阻遇，表现一种自我调节作用。（2）晚期基因表达需要T抗原及SV40DNA本身的复制。一般过程是，感染早期合成T、t抗原T-方面抑制早期mRNA进一步合成；另一方激活多种与DNA复制有关的酶，引发病毒的复制进而推动晚期RNA的合成，产生Vp蛋白（12h)V-DNA+VP123病毒颗粒。,（二）HBV基因组HBV是乙肝的病原体，它可造成持续性感染，引起急、慢性肝炎，部分患者可发生肝硬化，HBV原发性肝癌发生密切相关，我国HBSAg携带者高达10%，因而我国特别重视HBV的研究。,1、HBV基本结构（1）电镜下观察呈园球形，直径约42nm，称Dane颗粒（以发现者命名）；中间含1个致密的内核（core)，直径约27nm；外为1层约14nm外壳（capsid)。（2）表面有HBsAg（hepatitisBvirhssurfaceantigen)；核心有HBcAg和HBeAg；含DNApol、proreinkinase(蛋白激酶）和reversetranscriptase（逆转录酶），后者与病毒复制特点有关。,2、HBV基因组结构（1）ds()DNA组成的环状结构，开环不封闭。侵入细胞后借助胞内DNA修复机制转变成cccDNA分子（共价闭合环状超螺旋）。（2）基因组双链DNA长短不一，外长内短，长负（链）短正（链），长链2/3是双链，1/3是单链。两链间隙由DNApol填充（上（1）述）。（3）长链（负链）基因重叠是转录mRNA的模板链.,不同毒株均含有4个开放性阅读框（openreadingframe,ORF见第五章)S.C.P.X，其中P区与S.C.X.互相重叠50%以上，故多个ORF可读码2次以上，编码2个以上蛋白质。其中：S区编码主要蛋白为HBsAgC区编码HBcAg等。P区编码DNApol是依赖RNA的DNApol（逆转录酶）。X蛋白功能不详。,4、HBV与肝癌的关系现在普遍认为，HBV感染与原发性肝癌关系密切，流行病学及分子病毒学的证据如下：（1）原发性肝癌（肝细胞性肝癌）HBSAg高达85%，其他肿瘤患者仅为15%；（2）培养肝癌细胞株，不断释放出HBsAg(+)；（3）cDNA探针检查到HBV已整合到肝癌细胞DNA中去；（4）肝癌病人的癌基因，如Ki-ras、Ha-ras、myc被激活。,(四)逆转录病毒1.逆转录病毒一般分类逆转录病毒可以说就是RNA肿瘤病毒。第一个被发现的RNA肿瘤病毒是劳氏肉瘤病毒（RousSarcomavivus,RSV,1911)。至今为止所发现的retro-v都能使动物致癌，如下。（1）肉瘤病毒（2）白血病病毒(leuremiavirus)（3）乳腺瘤病毒(mammazytumorvirus)和淋巴瘤病毒，如鸟类髓细胞瘤病毒（avianmyelocytoma,AMV)（4）人类嗜T细胞逆转录病毒（humanT-lymphotropicretro-v,HTLV)HTLV-III现称人类免疫缺陷综合症病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV)或AIDS病毒。,2.逆转录病毒基结构特征(1)是RNA的复合体2条(+)RNA单体正向平行,携带所有的遗传信息,而且完全相同,为什么要求2条相同正链,意义不太清楚(怕基因丢失或损伤?)。2条tRNA较小，是宿主tRNA(RSV是tRNAtrp），+RNA对于复制位置是至关重要。(2)5端有m7Gppp帽,3端有Poly（A）尾。,(3)编码区（反式功能区）从53非编码区（顺序功能区，调控区)5，3都有gag(groupantigen)编码衣壳蛋R区逆转录合成cDNA必须区域Pov(Polyrmerase)逆转录酶PB区引物结合区env(envelop)包膜蛋白U区U3含启动子，U5与转录终止加尾有关*ONC(oncogene)癌基因(包装信号),DLS(氢链结合位点)如RSV是SRCC为调控区*有的retro-V有ONC。,3.逆转录病毒生活周期（1）吸附可能所有的动物病毒受体都是表面糖蛋白（MLV的受体是左旋氨基酸转运蛋白，受体与基因治疗）。（2）入胞逆转录，转录，翻译。逆转录前病毒基因组（cDNA)的形成RNA+逆转录酶宿主胞浆逆转录（RNA为模板，+RNA为引物）cDNA（见第四章）进入核随机整合宿主染色体形成前病毒。(phag仅注入核酸）cDNA形成新的重复(U3-R-U5)称LTR(longterminalrepeat长末端重复顺序）。cDNA含有RNA全部信息且较RNA长。,逆转录酶除了逆转活性外，还至少还有3种活性：即RNaseH活性，内切核酸酶活性（特异地切断基因组3端RNA,作为“+”链DNA的引物）和以“-”链DNA为模板合成“+”链DNA的活性。,转录病毒基因组的形成U3区启动子启动前病毒基因组转录出从5区至3R区的RNA。翻译gag、env、polgag全长RNA能直接作为gag基因mRNA，进行翻译。但有90%的mRNA只译出gag多蛋白质，经肽链加工裂解为衣壳蛋白。polRNA序列有干扰gag终止码的序列，使约10%mRNA在翻译过程中，直至pol的终止码，经翻译后加工裂解，形成衣壳蛋白，逆转录酶和整合酶(integrase)。env一部分全长mRNA经过转录后的剪接，使env编码区与病毒RNA5端帽子连接在一起envmRNA包膜糖蛋白。,（3）病毒颗粒成熟包装（基因治疗）RNA5端PB-区与宿主tRNA以氢链相连形成复合体包装病毒颗粒。（4）释放子病毒感染其它细胞。,4.逆转录病毒引起白血病的3种机理.(以此说明RNA肿瘤病毒的致癌作用与基因组