细胞技术总论

细胞培养,Cell Culture,神经再生重点实验室 张琦 2011-04-18,2,第一章 细胞培养基本知识,一、组织培养的诞生与简史,细胞的发现：1665，Robert Hooke细胞学说：1838-1839，施莱登、施旺,3,19世纪后叶，胚胎学的发展较为迅速，人们在研究胚胎学时，将一些活的组织或细胞放在体外进行观察，这些组织在体外存活了一定时间，从而拉开了体外培养的序幕。,1859，法国解剖学家Vulpian最早尝试将蛙胚尾部组织切下，放到普通水内进行“培养”，结果观察到生长和分化现象。,1885，W Roux用温热的生理盐水在体外使鸡胚髓板组织存活了数天之久，被认为是体外培养的萌芽实验。他首次提出组织培养这一概念。,4,1897，B Loeb首次在含有少量血浆凝块的试管中培养成年兔的肝、肾、甲状腺与卵巢植块，发现这些植块在3d内仍能保持正常的组织结构。这被认为是器官培养的最早尝试。,1903，J Jolly用悬滴法将蝾螈的白细胞在体外维持了近一个月时间。,1906，SP Beebe和J Ewing以盖片悬滴培养法用动物血清使狗的淋巴肉瘤细胞在体外存活了约72h。,5,1907年Harrison培养蛙胚神经成功，开始创建盖片凹玻璃悬滴培养法。,1910、1912年Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法。,1923年Carrel设计创立了卡氏瓶培养法，用此法可根据需要随时更换培养液，既有利于组织不断生长，又可运用不同种类的营养液培养不同细胞，极大地推动了当时组织培养研究。,6,培养基方面的发展,1911，MR Lewis和WH Lewis探讨了NaCl，CaCl2，KCl，NaHCO3等生理盐溶液成分，提出了简单的人工合成培养基（实质是生理盐溶液）配方Ebeling(1921)、Drew(1923)、Carrel(1926)、Fishcher(1928)等学者分析和研究了血浆与胚胎浸出液中的营养成分1910Tyrode盐溶液1933、1938JPM Voglaar和E Erlichman人工培养液1943、1948WR Eargle盐溶液1948A Fischer辅助培养基V-614与V-6051949JH Hanks平衡盐溶液1955 HEargle人工合成培养基,7,细胞培养的特点,优点：1.活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动2.可控制： 选择对象：均一性、重复性 调节条件：各种因素，物理、化学、生物等因素 利用方法： 采用各种研究技术 记录方法： 倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦 显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记3.应用广： 学科多； 对象广： 各种动物：低等动物-高等动物-人类 一种动物：不同年龄- 不同组织- 正常或异常（肿瘤-）4.较经济：可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象,8,缺点：,现人工模拟体内环境的技术已经很高，但人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中久了，必然发生变化。1.与体内主要不同 相对孤立、相对单一， 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2.主要表现 失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显， 细胞趋向单一化 提示：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。,9,三、 培养细胞的特性,常见的几种类型（一）贴附型： 1、成纤维细胞型2、上皮细胞型3、游走细胞型4、多型细胞型（二）悬浮型见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。,10,1、成纤维细胞型,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2-3个长短不等的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状 细胞-细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起,11,成纤维细胞,12,HUVECs人脐静脉内皮细胞1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞；2.培养的天数：4d；原代培养；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：DMEM+15胎牛 血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭 形，扁平形或多角形，贴壁生长。,骨髓间充质干细胞1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；2.培养天数：7天；3.放大倍数：200倍，倒置显微镜；4.培养基种类：DF12+10FBS；5.细胞状态与特征简述：使用percoll密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液48h，这是7天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。,13,2、上皮型细胞,名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物，消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,14,上皮型细胞,15,SKOv3 （卵巢癌细胞）1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞）2.培养的天数：传代后3d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生 长，生长速度较快。,CCL-1491.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；2.培养的天数：1d（种在48孔板中）；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，34天传代一次，Giemsa染色。,16,3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。,CNE11.细胞种类：高分化鼻咽癌细胞系；2.培养的天数：3d；3.放大倍速：相差100；4.培养基种类：PMI1640+10%CS；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞， 梭型成团生长。,17,4、多型细胞型,有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,SD大鼠神经元 原代1.细胞种类：脑皮质细胞；2.培养的天数：4-5天；3.放大倍速：电镜20000；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清+10%马 血清；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴 突和树突。,18,悬浮型,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞),19,K562细胞1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；2.培养的天数：传代后2天；3.放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。,20,培养细胞的增殖特点,游离:悬浮,胞质回缩, 全部细胞变为圆球形;吸附:贴附底物,一般24小时内贴壁;潜伏期:可有运动活动,基本无增殖,少见分裂相.,21,在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。,22,培养细胞的生长过程,23,细胞系的生长过程,（一）、原代培养：组织细胞从体内取出后在体外生长环境中继续培养。一般为1-4周。原代培养期主要有以下生物学特点：1.黏附、组织分散制成细胞悬液，接种培养器皿后细胞黏附（贴壁），不同细胞贴壁能力不同，巨噬细胞、成纤维细胞黏附力强，几分钟数十分钟已贴壁。神经细胞等则弱。培养液中离子成份及其浓度能影响细胞贴壁。2.铺展、对贴壁细胞来说，只有铺展到合适程度DNA合成才开始进行。此种细胞在相差显微镜下观察；细胞 轮廓清楚、核隐约可见、常见核仁，细胞周围有光晕。细胞生长不良；细胞暗、轮廓明显、胞质中出现小颗粒和泡状结构。,24,3.细胞运动、这与细胞周边伸出的伪足有关细胞发生移动。4.细胞分裂、一般来说，原代培养的细胞至少要经过24-96h或更长时间才能分裂。不同细胞分裂、增殖活动恢复得快、慢不同。肿瘤细胞比正常二倍体细胞恢复得快。原代培养时接种的细胞密度大、潜伏期短，细胞分裂增殖活动恢复得越快。培养条件适宜、稳定、营养充足细胞分裂增殖活动恢复得快。,25,26,（二）、传代培养 原代培养的细胞增殖到一定密度后，要分离出一部分细胞并更新培养液，使细胞继续生长、增殖，这过程叫传代培养。 每次传代培养的细胞生长变化过程分为三个阶段；潜伏期、对数生长期、停滞期。1.潜伏期 传代细胞的恢复期或称适应期，又开始贴壁、铺展等过程。但很少分裂。它的长、短与细胞种类、接种密度、培养条件有关。一般为6-24h。,27,2.对数生长期 细胞增生最活跃、活力最旺盛阶段，细胞数量呈指数生长细胞分裂活动的程度。常以有丝分裂指数（MI）来表示细胞倍增的时间。MI是指培养细胞中分裂相数量占全部细胞数量之比。细胞倍增时间是指细胞数量翻倍的平 均时间。细胞接种数量适中，培养条件适宜情况下，指数生长期一般持续3-5天，细胞可长满器皿。出现接触抑制特征。肿瘤细胞无此现象。3.停滞期 细胞不再分裂增殖，细胞数量多、营养消耗大、培养液中废物，细胞生长活动极为缓慢变性死亡。注意；1、稳定培养条件-营养、酸碱度。 2、减少传代次数，一般3-5代为好。为了保证是二倍体细胞，应尽早冻存。,28,29,培养细胞的生长的条件,细胞的营养需要基本营养物质促生长因子等物质细胞的生存环境温度气相及pH渗透压无污染及无毒,30,第二章 培养细胞室的设置、设备和准备工作,31,一、细胞培养室 设计原则：防止微生物和有害物质的影响，要求环境整洁，空气清新、无尘、干燥、可调温，避免空气流动！ 细胞培养室按功能可分为准备室，缓冲室，培养室。,32,（一）准备室 准备工作的好坏直接影响细胞培养的结果。有条件可以将其分成几间：清洗、干燥、包装在一室，消毒、纯水制备在另一室。不同用途的培养皿应分开清洗，消毒。 （二）缓冲室 一般应35，紫外灯距离地面25m。工作人员可在此更衣。室内可放恒温箱、水浴箱、离心机、冰箱等物。（三）培养室是专用于细胞培养和各种无菌操作的地方，应清洁、干燥、不通风、光线好。墙、地应光滑，易清洁。 按国家标准：百粒级实验室 0.5微米尘埃粒子数应3.5个L，5.0微米尘埃粒子数应0个L。万粒级标准 0.5微米尘埃粒子数应350个L，5.0的应2个L。,33,净化工作室,34,风淋室风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口不锈钢制作，吹淋口方向可调，风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。,35,二、超净工作台 利用鼓风机，使空气通过高效空气微粒滤层 HEPA 净化后，使工作场地形成无菌环境。可分侧流式、外流式。前者是气流从上向下流向工作台面或气流从左向右流向对面，形成气流屏障。后者是气流向操作者方向流动，使外面的空气不能混入。 注意：感到气流变弱或酒精灯火焰不动，表明HEPA层阻塞，需维修或更换。,36,超净工作台,37,38,三、 培养箱 选择灵敏度高、温控精确，能恒定一定量CO2的培养箱。一般为5%CO2 95%空气，温度370.5度，箱内保持一定湿度，一般用无菌蒸馏水。使用培养并时应拧松瓶子盖。保持培养容器与箱内气体处于交通状态。 注意：对培养箱要定期消毒。培养液的pH值一般为24。 还有三气（CO2、N2、O2）培养箱，适用于细胞缺氧或高氧方面的研究。,39,细胞培养箱,40,四、倒置相差显微镜 活细胞不能染色，用此镜能很好地显示细胞的形态。,倒置相差显微镜,41,42,五、冰箱 一般可分普通冰箱和低温冰箱。普通冰箱内存放一般的培养液、缓冲液等。血清、酶、配制的抗生素、谷氨酰胺溶液、抗体等为了保持其生物活性应放低温冰箱中保存。 六、离心机 一台低速、水平式离心机，最好带控温装置。,离心机,43,七、低温贮存装置：液氮罐（运输、贮存用）。液氮温度-196八、水的纯化装置：石英玻璃蒸馏器、进口纯水仪。可制备出供培养用液的优质水。 九、PH计：台式、笔式，配制培养用液时调节pH值。 十、其它：天平、高压蒸汽消毒锅、干燥箱、过滤除菌装置、移液器，各式各样培养皿、培养瓶、冻存管、离心管，各式吸头、吸管等。,44,水浴箱,干燥箱,纯水仪,45,细胞培养的实验用品,细胞培养瓶 25平方厘米75平方厘米150平方厘米,46,细胞培养板6孔12孔24孔48孔96孔,47,细胞培养皿35mm60mm100mm,48,冻存管1.2ml 2ml，5ml,49,离心管15ml50ml细胞刮,50,滤 器,大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。,51,抽滤装置：,抽气,滤膜0.22u,加压,滤膜0.22u,负压,正压,52,53,液氮罐,54,55,培养工作需要大量消耗性的物品；玻璃器皿、器械、塑料制品、纸等物品。一般 用品都有需洗净后反复使用，因此体外培养大量的工作是清洗和消毒。,清洗与消毒,56,细胞培养常用器材处理方法,体外培养细胞使用的器材品种较多。离体细胞对各种毒物都很敏感，所用器材的清洗、消毒处理是培养能否成功的关键之一。,清洁液的配制,57,一、玻璃制品的清洗 由于培养工作中用量大，加之反复使用，因此清洗要严格要求，洗净后的器皿清澈透明，不留任何残余物。清洗工作包括；浸泡、超声、浸酸、冲洗四步。1、浸泡；器皿在加中性洗涤剂的液体中浸泡数小时。新购的玻璃器皿必须彻底清洗。2、超声；在加有中性洗涤剂的超声槽中超声30min。注意超声前每个器皿内均要浸满洗涤液，若有的物品比较轻，可以用网篮扎好后放入。 3、冲洗，用水冲净，稍凉干后浸酸。,58,4、浸酸-清洁液，一般浸泡6h以上。以配制中等强度清洁液为例；重铬酸钾120g、浓硫酸200ml、蒸馏水200ml。注意；应配制在耐酸、耐热，大口容器中。水和重铬酸钾先加入容器中。将硫酸按量缓慢加入（很慢），边加边搅拌。加完硫酸，待液体自然凉，重铬酸钾完全溶解后才能使用。新配制的液体为红棕色变暗发绿-弃之。5、冲洗，及时冲净（不挂水为止）6、烘干。二、塑料及橡胶制品 用水浸泡超声冲洗浸酸（1%盐酸，6h）冲洗烘干。,59,三、物品的包装及消毒 1、 洗净、烘干的物品应及时包装，常用牛皮纸、棉布、铝盒、以及专用金属消毒筒等。物品应标明品名、日期。 2、消毒 用压力蒸气灭菌，玻璃器皿一般15压力（ibf)-121.压力维持30min。培养用的液体以及塑料、橡胶制品常以10ibf-115，维持10min。 过滤除菌；有塑料、不锈钢微孔滤膜滤器，用正压过滤除菌。塑料的一般为针式滤器，直径25mm和50mm两种。不锈钢微孔滤膜滤器有500和1000ml两种。除菌用微孔滤膜，孔径为0.22um。注意滤完后要检查滤膜是否完整。 电离辐 射灭菌；核素产生的r射线或电子加速器产生的加速离子辐射物品杀细菌和微生物的方法。 环氧乙烷，化学灭菌。,60,第三章 细胞培养用液及培养基,体外培养离不开细胞在体外生存和生长的各种液体环境-培养用液，因此其各种成份必需严格选择，有严格的制备操作过程。 培养用液主要包括: 培养液、缓冲液、平衡盐溶液、血清、PH调整液、抗生素液等。所有用液均除菌后标明名称、日期、 PH值，在适当温度下贮存。,61,一、水与缓冲液 （一） 水 是培养用液最主要的溶剂，是细胞赖依生存的环境。 对水质要求高；三蒸水、去离子水、超纯水。 此外，水的贮存也很重要；贮存于密封、洗净玻璃并内，时间2W，最好是现制现用。,62,（二）缓冲液 由弱酸/弱酸强碱组成的盐或弱碱/弱碱强酸组成的盐如碳酸/碳酸氢钠，磷酸二氢钠/磷酸氢二钠。 细胞生活环境中无机盐种类很多，因细胞、组织的不同而不同，在所有细胞中无机盐都以离子状态存在。 Na能增高细胞膜的渗透性，对维持细胞渗透压有决定性作用， Na 、 Cl-是细胞外液主要电解质，是维持细胞外晶体渗透压主要成份。NaCl一般维持在0.9%浓度水平。,63,Ca离子 尽管它在细胞内含量不到人体总量的0.1%，但它是细胞内外一种非常重要的元素；它对细胞间相互粘着起着十分重要作用，在细胞内参与许多重要的生理活动（跨膜信号转导、肌肉收缩活动、神经递质的释放过程、激素分泌的调控等），它还是第二信使，它与胞浆中钙调蛋白结合调节细胞生命活动。 Mg离子 是构成细胞间质的重要成份，对细胞间相互稳定结合有重要意义；在细胞内参与ATP酶催化的每个反应，多种酶都以它作为辅助因子（N-M传导也需它的参与）。,64,PO4离子 磷的化合物对细胞代谢和生理功能调控，是广泛而不可缺少的。 碳酸盐缓冲对是体内最重要的缓冲体系。葡萄糖 为生命活动提供能量，一切组织、细胞都可利用它供能。,65,细胞在体外生长的环境是人工模拟的，除了必须提供适当的温度，空气，无菌等条件外，最重要的是使细胞赖以生存的培养基接近于体内的生理环境，保证细胞能够正常生存、生长，并维持其结构及功能。培养基的种类很多，按其来源分：天然培养基和合成培养基；按其状态分；半固体培养基和液体培养基。,66,二、培养基,（一）、营养成分 1、氨基酸：主要需要以下12种必须氨基酸，精、胱、异亮、亮、赖、蛋、苯丙、苏、色、组、酪、颉，它们都是L型的。 2、单糖：六碳糖是主要的能源，也是合成氨基酸的原料，吸收能力最强的是葡萄糖、半乳糖最低。 3、维生素：主要扮演辅酶、辅基的角色，因此是必不可少的。 4、无机离子和微量元素： 细胞生长过程中除需要钠、钾、钙、镁等基本元素外，还需要一些微量元素，铁、锌、锰、钼等。,67,（二）、促生长因子及激素,体内生长需要因子的刺激、调节，体外同样需要，愈来愈多的实验证明各种激素、生长调节因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态具有十分重要的作用。,（三）、渗透压,细胞必须生活在等渗的环境中，大多数细胞对渗透压有一定的耐受性。人血浆的渗透压是290mOsm/kg,可视为培养人体细胞的理想渗透压。对于大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260320mOsm/kg的范围内都适宜。,68,（四）、pH,大多数细胞的适宜pH为7.27.4，偏离此范围对细胞产生有害影响，培养基应具有一定的缓冲能力。造成培养基pH波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2, 在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。为了解决这一问题，合成培养基中采用了NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放式培养的方式，使细胞产生的CO2及时逸出培养器皿，再通过稳定调节温箱中的CO2气体的浓度（5%），使之与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。,69,（五）、无毒、无污染,体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质无任何抵抗力。因此，培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染。,70,天然培养基,天然培养基主要是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如：血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。 组织培养的早期都是用天然培养基，天然培养基含有丰富的营养物质及各类细胞生长因子、激素类物质、渗透压、pH等也与体内环境相似乎，但过程复杂，因此逐渐为合成培养基所代替，目前仍然广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织液、促进细胞贴壁的胶原类物质。,71,一、血清 由血浆去除纤维蛋白而形成，含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。,（一）血清的种类： 主要是牛血清，当然特殊需要时用人血清、马血清、猪血清等。牛血清分为小牛血清（10到30天），新生牛血清（24小时）、胎牛血清（剖腹产）。常用的血清胎牛血清-FBS 对多种细胞有促进生长作用，用于细胞株保藏 及特殊细胞株的培养。新生牛血清-NBS 出生后10天内的小牛中获得。马血清-HS 它常与胎牛血清联合使用，用于神经细胞、 PC12细胞株等培养中。兔血清，羊血清,（二）血清的作用,1、提供基本营养物质。2、血清中含有各种生长因子，以刺激细胞生长。3、血清中含有结合毒性物质的因子，可以解除脂肪酸、重金属、蛋白酶等的毒性及中和胰蛋白酶的活性。4、提供贴壁物质以利于细胞贴壁生长。5、提供激素、微量元素以及目前还未了解而细胞又需要的物质。6、对培养基中的细胞提供某些保护作用。,1、对多数细胞而言：体内状态时，细胞并没有直接与血清接触，只是损伤愈合时才接触血清，因此，使用血清有可能改变某种细胞的体内生长状态。2、血清成份太复杂，据估计多达几百种，因而对于物质-细胞间相互作用机理的研究难以进行，特别是微量生物活性物质的研究。3、血清各批号间差异较大，实验的标准化和稳定性受到限制。4、血清在含有促进细胞生长物质的同时也含有抑制细够生长的物质，甚至细胞毒性物质。 5、血清中不能排除含有诱变物质，这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。6、血清是病毒和支原体污染的主要来源。7、血清使生物制品生产工艺复杂化。,（三）血清使用的弊端,理化性质：渗透压、pH、蛋白质电泳图谱、蛋白质含量、激素水平，内毒素等。蛋白质含量包括：总蛋白、球蛋白、血红蛋白等。微生物检测 : 细菌、真菌、支原体、病毒等，特别是支原体、病毒等的检测。促生长效果：这是血清的最重要的特性之一，应当以培养的细胞来检测，有两种方法：克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。,（四）血清的质量标准,75,使用前的处理：经过灭活处理，即56 放置30分钟。主要的目的是去除血清中的补体成分。储存条件: 血清一般储存于-20 ，同时应避免反复冻融。使用浓度： 一般为5%到20%，最常用 的是10%。,（五）、血清的使用与贮存,76,二、鼠尾胶原,严格意义上说，鼠尾胶原并不是一种培养基，它不能够提供细胞生长所需的营养物质，它的主要作用是促进细胞的贴壁，特别是对上皮细胞。上皮细胞在体内多生长于基膜之上，基膜的主要成分是胶原。,三、组织浸出液,最早使用的组织浸出液是鸡胚浸出液 ，鸡胚易获得，取材简单，鸡胚浸出液 的主要成分是大分子核蛋白和小分子氨基酸，有刺激细胞生长的作用。,77,合成培养基,研制的培养基只有在加了少量天然培养基后才能使细胞生存，这种研制的培养基称为基本培养基或通用培养基。它在添加了一定比例的血清之后，称之为“完全培养基”。,一、基本培养基,78,（一）基本组分： 低限量基础培养基（MEM)，它含有20多种物质，可以认为这些物质就是培养基必不可少的基本成分。基本组分包括四大类物质，即无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。还要加入酚红，一种pH指示剂。MEM并不是常用的基本培养基，常用的基本培养基都含有30多种成分，如RPMI1640、DMEM,一般是增加了非必须的氨基酸和维生素，如：丝、脯；生物素、Vb12等。,（二）种类： 目前的基本培养基已达数十种，其中较常见的有以下几种： 1、 MEM： 也称为低限量Eagle培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺，8种维生素和必需的无机盐，成分简单。,79,2、DMEM: 是由Dulbecco等人在MEM培养基的基础上研制而成。主要是增加了各成分的含量，同时又分为高糖型和低糖型（4500克/L,1000g/L)。高糖型利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快，附着较困难的肿瘤细胞。,3、IMDM :是 Iscove等人对DMEM培养基的改良结果，含有42种成分，与DMEM相比，增加了许多非必须氨基酸及一些维生素，增加了HEPES，葡萄糖含量为高糖型。它适合于密度较低，生长较困难的细胞。,4、RPMI1640: 它由Moor 等人研制成功，其组分简单，适合于许多种类细胞的生长，它是应用最广泛的培养基之一。,80,5、199、109培养基 199培养基是Morgan等人在1950年研制成功的，是最早出现的培养基之一，成分有60多种，几乎含有所有氨基酸、维生素、生长激素、核酸衍生物等。,6、HamF10、HamF12 : F10培养基适合于小鼠二倍体细胞，也适合于人二倍体细胞，F12特点是配方中加入了一些微量元素和无机离子，可以在少量血清的情况下应用，它是无血清培养基中常用的基础培养基。,7、McCoys 5A 1959年研制成功，它特别适合于培养肉瘤细胞，及其他原代细胞培养。,81,（三）、培养基的配制 1、认真阅读说明书 2、配置时要保证充分溶解 3、配制的水应是双蒸水或三蒸水 4、器皿要干净 5、pH值调整达到7.27.4 6、配制好的培养基要马上过滤，无菌保存于 4 7、无菌试验,82,二、无血清培养基,目前无血清培养主要从以下两个方面进行研究： 1、基础培养基的优化。 2、附加成分的摸索激素、生长因子、细胞附着蛋白、金属离子转移蛋白、细胞结合蛋白、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂和微量元素等。 机体内各种细胞所需生长条件各不相同，要设计出一种万能无血清培养基是非常困难的，而且也不一定有这种必要。,83,无血清基本培养基的基本配方： 分为基础培养基和添加组分两大部分。基础培养基以F12和DMEM最为常用一般以1：1混合。添加组分包括以下几大类物质： 1、促贴壁物质 2、促生长因子 3、酶抑制剂 主要是终止酶的消化作用，达到保护细胞的作用，常用的是大豆胰酶抑制剂。 4、结合蛋白和转运蛋白 常见的有转铁蛋白和牛血清白蛋白（量比较大，可以增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤）。 5、微量元素：硒是最常见的,还有铁、锰、铜锌等。,84,限定化学成分培养基（CDM),同样不含蛋白，也没有添加植物水解物，而是使用一些已知结构和功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。它有利于分析细胞的分泌产物，目前已有适合于293细胞、CHO 细胞，杂交瘤细胞生长的CDM问世。,从生物技术的发展趋势看，不含动物蛋白的培养基有广阔的应用前景，许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体，如用含有动物蛋白的培养基，纯化过程较复杂。目前已经有适合于CHO细胞生长的PFM，如GIBCO公司的CHO-A PFM.,三、无蛋白培养基(PFM)和限定化学成分培养基,85,三、体外培养的其它用液 （一）消化液：用于原代细胞培养和细胞传代时。 胰蛋白酶：是从牛或猪胰中提取，黄色粉末，易潮解，放暗、冷、干处保存。常用浓度0.25%、0.125%、0.08%。它在 PH 8.0, 37时作用力最强,主要是使细胞间的蛋白质水解,细胞离散.不同组织或细胞系对胰蛋白酶反应不同.配制时，要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液，这些物质会对酶产生抑制作用，它溶解的最佳pH是89，配时应将溶液调至8左右，溶解、过滤、除菌，过滤后将溶液再调至7.5左右，也可不调。 EDTA：化学螯合剂,对细胞有一定离散作用,毒性小,使用方便, 浓度0.02%,常与胰蛋白酶同时使用。但分离效果较差，EDTA成分不易从培养液中除去。 胶原酶：又称羟肽酶，在上皮类细胞原代培养时经常使用，它作用的对象是胶原组织，因此不易对细胞产生损伤。使用浓度为0.10.3mg/L或200000U/L,作用的最佳pH为6.5。胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS.,86,（二）、PH调整液 1、NaHCO3 在水溶液中易发生分解释放出CO2，因此一般不预先加在培养液中，单独制备，消毒、除菌后在使用前加入调整PH值。常用浓度5.6%,3.7%等.注意： NaHCO3加入时要一滴一滴加，要搅拌均匀，防止过量。 2、HEPES 羟乙基哌嗪乙硫磺酸。对细胞无毒害作用，是氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的PH值范围(可维持在 pH7.0左右)。一般培养液内终浓度为20mmol/L，除菌、分装，4保存。,87,（三）、抗生素液,（四）、谷氨酰胺补充液,常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液”，青霉素主要对革兰氏阳性菌有效，链霉素主要对革兰氏阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌的污染。一般使用最终是100U/ml。可用PBS或培养基配制。100倍抗生素配制完后除菌分装，-20 保存。,谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺容易降解，所以都是在使用前添加。谷氨酰胺使用的最终浓度为0.002mol/L.一般配制为100倍浓缩液，配制时应加温至30度，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于-20 。,88,细胞在体外存活、生长，需要模拟一个体内生存的环境。除了有足够、合理的营养外，还须为细胞提供一个稳定的培养温度、渗透压和氧气环境。,细胞体外生长的其它条件,89,一、创造出一个无菌的气-液环境 1、体外培养技术最强调无菌技术，其包括组织取材、分离、种植、传代整个实验过程中。 2、培养用的各种器具、液体应按无菌要求制备。 3、供应气体的方式是向培养箱内通入一定比例CO2、空气（5%CO2，95%空气）。空气中主要是O2，95%空气内含O2浓度为21%，O2和CO2以气体扩散方式进入培养液和培养物内。O2浓度60%时为高氧环境，对细胞有毒害作用。O2浓度1%-4%为低氧环境，影响细胞代谢。CO2与培养液的酸、碱度的维持有关。培养箱内加工5%CO2，它扩散到培养液中，可维持培养液PH7.2-7.4范围. 4、细胞在体外环境中生存为了保持细胞内外渗透压的平衡，在配液时应严格按配方要求进行。,90,二、温度 细胞体外培养最适温度370. 1，偏离这温度会影响细胞正常代谢和生长,最终导致细胞死亡。三、生长基质 体外培养的细胞，失去了在体环境下生存的环境，为了使细胞能较好的生长，在培养液中或在培养器皿上，包被生长基质，它有助于细胞粘附、贴壁生长。生长基质主要是细胞外基成分。,91,最常用的；1、多聚赖氨酸 由赖氨酸单体聚合而成，分子量7-30KDa。一般用PBS或BSS配成贮存液0.5mg/ml，工作浓度50ug/ml。方法；加入工作浓度的液体量，以覆盖培养器皿底为宜。 包被时间；37下2-4h，室温下，过夜。 除去多余的包被液，用基培洗1-2次。 最好现用现配，以防污染。,92,2、纤维粘连蛋白：是位于细胞表面和血浆中的大分子蛋白质，有维持细胞结构、促进细胞粘附的功能。工作浓度1mg/ml可以包被在器皿表面。3、胶原：来自动物组织-鼠尾胶、牛的真皮等。以鼠尾胶为主，其粘度大、半透明，难以过滤，在制备中应特别注意无菌操作。商品胶原1-3mg/ml。溶解在无菌PBS或0.1mol/L盐酸或醋酸中,分装后-20保存。4、层粘连蛋白(laminin)：是细胞外非胶原性糖蛋白，分子量900KDa，可影响细胞 粘附，调节细胞的生长、分化。工作浓度5-10ug/ml，包被在器皿上，30min后即可使用。,93,94,第四章 细胞培养的基本技术,培养室内的无菌操作培养前准备培养室和超净台的消毒洗手和着装无菌培养操作,95,培养细胞中常用技术,1、细胞分离：酶消化法常用胰酶、胶原酶，结合机械过滤或密度离心。反复贴壁法利用不同细胞贴壁速率的差异。机械刮除法机械去除不需要的细胞。2、细胞传代：胰酶或EDTA消化传代。3、细胞计数：利用血球计数板计数。4、细胞冻存和复苏：含5-20% 的甘油或DSMO的培养基 作为冻存液，缓慢降低温度，最终放入液氮中。复苏时快速升温到37度。,血球计数板16格=0.1ul,96,5、活力测定：台盼兰染色法测定死细胞数。MTT比色法测定胞内琥珀酸脱氢酶活力。其测定值与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比 。MTT只能测相对值。6、分裂指数 ：分裂细胞的百分比，用盖片培养，染色、计数。7、细胞周期：缩时摄影；同位素标记；细胞计数；BrdU渗入等。8、细胞克隆：单细胞无性繁殖过程。建株，保持性状均一。9、细胞融合：两种细胞的融合，以获得所需的性状；基因定位。,97,细胞培养失败的常见原因,1、细菌、霉菌、酵母菌等污染。2、支原体、病毒污染。3、水质。4、培养瓶/板材料、吸管、试剂瓶等用具的洁净程度。5、细胞密度。6、培养温度与CO2浓度、培养基pH。7、操作损伤（如手术器械和吸管温度太高时取细胞、分离细胞时机械损伤、酶消化过度等）。8、特殊细胞培养时培养基种类和特殊添加剂（如淋巴细胞+PHA) 。9、组织细胞本身不适合培养（某些分化末端细胞、老化细胞等）。,98,培养物的污染 与培养无关的杂质混入培养系统称污染。 常见有细菌、真菌、支原体、病毒等。可以通过目测、显微镜观察、特 殊染色鉴定、微生物培养、免疫学和分子生学方法进行确定。,99,细菌污染： 它是一种原核细胞微生物，大小是um级。污染初期因培养液中有抗生素，抑制其繁殖，镜下不易发现。细菌增殖后，可导致培养液外观发混由于代谢产物累积培养液呈现黄绿色。 真菌污染： 是真核细胞微生物，单细胞真菌称酵母菌，多细胞真菌能长出菌丝及孢子，交织成团，称丝状菌-霉菌。污染了霉菌的培养物在倒置显微镜下可见呈丝状或树枝状生长的菌丝，它会很快蔓延。它对干燥、阳光、紫外线、一般消毒剂有较强抵抗力。 支原体： 直径0.2um左右，无细胞壁、有高度异型性、可穿过常规除菌滤膜的原核生物。对65下灭活、普通消毒剂、清洁剂都较敏感，受污染的细胞在镜下无特殊的外观表现，培养液不浑浊。在培养中发现破碎细胞多，需不断改善营养环境才能传代培养时，应怀疑其污染。,100,细胞细菌污染高倍镜图片（1000倍）,101,白色念珠菌污染,102,真菌感染,103,支原体污染,104,支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状,105,污染的预防一、培养操作前注意：定期更换超净工作台的空气滤网，定期检查超净工作台的空气净化标准，工作前提前启动超净工作台、紫外灯消毒，检查培养液是否无菌，操作者应清洗双手。 二、操作时注意：在超净工作台台面放置的培养瓶瓶口不能与风向相逆、不允许用手触及器皿的无菌部分，安装吸管帽、开启或封闭瓶口操作时要经过火焰烧灼，培养液开瓶后应保持钭位，不用的培养液应立即封瓶口，操作时不要交谈、咳