现代分子诊断技术

第七章 现代分子诊断技术,酶联免疫吸附测定 DNA诊断系统 DNA指纹 遗传性疾病的分子诊断技术,基因诊断,基因,蛋白质,性状,生化诊断,基因诊断,临床诊断,传统的诊断程序先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比较特异诊断成本高、速度慢、效率低如砂眼衣原体、朊病毒,检测寄生虫感染的诊断方法的比较,现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进行诊断检测一种有效的诊断方法应具备：1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应2、灵敏度(sensitivity)高3、操作简单(simplicity),基因诊断的特点,特异性高检测目标是基因，为原始的致病因素灵敏度高待测标本往往微量，目的基因只需pg水平稳定性高基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态诊断范围广，适应性强确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态临床应用前景好,基因诊断优点,从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制显著提早产前诊断的时间无需对组织、器官或细胞进行选择快捷准确、安全,基因诊断常用的技术,核酸分子杂交PCR（聚合酶链式反应）限制性酶切分析SSCP（单链构象多态性分析）DNA 测序 DNA 芯片技术,DNA Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, micoarray, restriction analysis, RFLP，SSCPRNA Northern blot, RT-PCR, micoarraysProtein Western blot, Immuno-histochemistry, microarray,Southern blot,N,N T T N T T,FISH,PCR技术,DNA测序,指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）,由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术,DNA芯片技术的概念,DNA芯片技术原理,大规模集成的固相杂交 基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息,DNA芯片技术流程,Scanner,microarray,“Hybridize”,arrayer,Microarray fabricationSample preparationMolecular hybridizationDetection and analysis,基因诊断的原理,利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA或RNA水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法策略检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因检测与某种遗传标志连锁的的致病基因检测表型克隆基因,基因治疗的机理,基因置换：正常基因取代致病基因 基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列 基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能 基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达 基因封闭：封闭特定基因的表达 “自杀基因”的应用 免疫基因的治疗 耐药基因的治疗,美国医学家WF安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例,1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。,谢德尔，1999,分子诊断,利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质。,分子诊断,遗传性疾病的诊断,羊水和胎盘绒毛膜检测,第一节酶联免疫吸附测定,抗体高度特异地与抗原分子结合通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA),一、酶联免疫吸附测定的原理,工作原理：主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体,二、检测过程：将待测样品结合在固相支持物（如96孔的微量滴定板）上加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（primary antibody）,反应后冲洗，将未结合上的一抗洗去加入二抗（secondary antibody），二抗通常只特异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去加入无色底物,双抗体夹心法,检测大分子抗原,间接法,检测抗体,竞争法,测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体,双夹心法,测定大分子抗原,特异性相同，来源不同,3、使用多克隆抗体的缺点同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备的抗体的量之间也会有差异无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，因为在ELISA检测中都会发生颜色变化单克隆抗体特异性强 只结合抗原上某一单一位置,4、酶联免疫吸附测定的局限性仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进行western检测要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特异性在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结合,第二节 DNA诊断系统,DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物学特性的DNA序列都应该是独特的，都可以作为专一性的诊断标记,一、核酸杂交,1、工作原理： 两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成氢键2、3个关键要素： 探针DNA 目的DNA 信号检测,主要依据： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 GC ; DNA与RNA杂交: A=U、 GC ; 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链,碱基互补,核酸分子杂交（固相杂交）操作程序,制备待测