遗传与育种学实验

遗传学实验,宁波大学生命科学与生物工程学院生物科学与技术系,实验目录,实验一：减数分裂的观察实验二：果蝇杂交实验 1、果蝇培养及主要性状观察 2、果蝇的单因子杂交实验 3、果蝇的双因子杂交实验 4、伴性遗传 5、三点测交实验三：果蝇唾液腺染色体的制备与观察实验四：核型分析实验五：同工酶技术实验六：DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验七：RAPD-PCR技术,实验一：减数分裂的观察,实验目的：掌握减数分裂制片方法和技术； 观察并熟悉减数分裂各期染色体的特征。材料：蝗虫精巢步骤： 捕捉雄性蝗虫，解剖取出精巢，Carnoy固定液（无水乙醇: 冰醋酸=3:1）固定三小时，70%酒精保存。实验时先在一张干净的载玻片上滴1滴醋酸洋红，然后取一根精细管，放在醋酸洋红染液中染色510分钟，盖上盖玻片后压片（指压法，笔头敲击）观察。 注意压片时要小心，避免压破玻片，并尽量使材料散开，以免细胞重叠影响观察。,减数分裂各期特征：,前期I： 1、细线期特点：染色质凝集，染色体呈细长单条线状，盘绕成团，此时染色体已经过复制，但看不出是成双的。 2、偶线期特点：各对同源染色体配对（联会），结果细胞中的染色体由2n单价体变成了n条二价体。,1、细线期和2、偶线期,3、粗线期特点：又称重组期，开始于同源染色体配对完成后，n个染色体（配对的染色体称二价体）进一步变短变粗，SC（联会复合体）仍然存在，同源染色体的非姊妹染色体间可以发生局部交叉和交换，核仁大。,3、粗线期,4、双线期特点：又称合成期，可见四分体。染色体进一步缩短，组成二价体的两条同源染色体表现相斥而分离，但由于同源染色体之间的交换尚未完成，因而在不同的二价体上，在不同的部位，不同程度出现交叉现象，使二价体成为“X、V、8、0”等形状。,4、双线期,5、终变期特点：又称再凝集期。四分体较均匀地分布在核中，交叉向染色体臂的端部移行，称为端化。染色体凝集成短棒状。,5、终变期,中期I： 纺锤体形成，排在赤道板上的二价体开始分离，交叉端移。,后期I： 二价体中的同源染色体分开，真正减数。末期I：,前期II：中期II：具有两个染色单体的染色体 排在赤道板上。,后期II： 着丝粒纵裂，姐妹染色单体分开。,末期：染色体解旋，核膜重建等。,实验报告,根据你所观察的结果绘制蝗虫精巢减数分裂过程中的染色体图像,实验二：果蝇杂交实验 1、果蝇培养及主要性状观察,一、遗传学实验常用的五个果蝇品系： 品系 体色 翅形 眼色 刚毛 野生型： 灰身、长翅（翅过体）、 红眼、 直刚毛 黑檀体： 黑身、长翅（翅过体）、 红眼、 直刚毛 白 眼： 灰身、长翅（翅过体）、 白眼、 直刚毛 小 翅： 灰身、小翅（翅近体）、 白眼、 焦刚毛 残 翅： 灰身、残翅（一点翅）、 红眼、 直刚毛,刚毛类型：,直刚毛,焦刚毛,Eight morphological mutations of Drosophila, and the wild type for comparison. Vestigial wings （残翅）。,二、雌雄果蝇的鉴别： 性别 体型 腹部末端 背部条纹 性梳 雌性 大 无色、端尖 7条（可见5条） 无 雄性 小 黑色、钝圆 5条（可见3条） 有 性梳：雄果蝇前翅第5节跗节上10根象梳子的棕毛,These two flies are both of the wild type for all traits. This means that they have all of the so-called normal alleles found in a natural population, and do not have any mutant genes.,the wild type,三、果蝇培养基的配制,（一）生活史：卵幼虫蛹成虫。,.,（25）,最适温度：2025度，从卵到成虫约需15天。,三、果蝇培养基的配制,（二）玉米粉培养基配方：A：蔗糖 13克+琼脂 1.5克+水 80毫升B：玉米粉 17克+水80毫升C：酵母粉 1.4克先将A煮沸，使琼脂融化，然后将B加到A中，煮沸后加约1毫升丙酸（抑菌），待稍冷却后再加入C，搅拌均匀后分装。,三、果蝇培养基的配制,（三）注意事项：配制培养基前先要对指管及棉塞进行消毒处理，121 25分钟；分装时培养基不要碰到管壁；酵母粉可以等到玉米粉煮沸后再加，这样可以避免高温使酵母失活；培养基刚配好后，管壁上会有许多冷凝水，此时不要急于把果蝇放进去，以免造成果蝇死亡；56对果蝇 / 管。,四、果蝇杂交验证遗传规律,黑檀体、小翅 培养 78天后杀死亲本 子代出来时开始收集处女蝇(why?) 黑檀体 小翅 小翅 黑檀体 数量够45对后开始杂交 数量够45对后开始杂交 正交 反交 78天后 杀死亲本 (why?) 78天后杀死亲本(why?) F1 F1 取F145对 取F145对 自交 自交 78天后杀死F1 (why?) 78天后杀死F1 (why?) 统计F2代数量（统计810天） 统计F2代数量（统计810天） 统计分析,正交组合,灰体.小翅.白眼.焦刚毛 黑檀体 + msn3w Y ee + + + F1+e +m +sn3 + w +e + Y F2,反交组合,灰体.小翅.白眼.焦刚毛 黑檀体 + mm sn3sn3 w w ee + Y F1 +e +m +sn3 + w +e msn3 w Y 三点测交 F2,统计分析,1. 单因子：只考虑体色，正、反交数量都可以2. 双因子：考虑体色和翅形，用正交得到的数量分析。3. 伴性遗传：只考虑眼色，正交和反交都符合，但应分开统计。4. 三点测交：研究位于性染色体上的三个隐性基因，只能用反交的数量，因为只有反交的F1代自交才符合三点测交的组合。,实验三：果蝇唾液腺染色体的制备和观察,实验目的：1. 练习分离果蝇幼虫唾液腺的技术，学习唾液腺染色体制片方法2 .观察果蝇唾液腺染色体的结构特点,实验三：果蝇唾液腺染色体的制备和观察,实验原理： 双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到一定阶段后就不再进行有丝分裂而停止在分裂间期，但随着幼虫的生长，唾液腺染色体仍然不断进行自我复制而且不分开，经过多次复制形成10004000拷贝的染色体丝，称为多线染色体或巨大染色体。 多线染色体上横纹的数目、大小和位置是恒定的，代表果蝇种的特征。,实验三：果蝇唾液腺染色体的制备和观察,实验步骤：1.取一条肥大三龄幼虫(往往已爬上培养管壁）置于载玻片上，并加一滴生理盐水2.在解剖镜下，左手用一解剖针压住幼虫尾部1/3处，右手用另一解剖针压住幼虫头部黑点处，用力向前拉，使得头部从身体分离，体内器官也被拉出，这时可以看到一对透明的香蕉状（棒状）唾液腺，两侧常带有黑色脂肪体，在解剖镜下小心剔除脂肪体。,3.剔除完脂肪体后，滴1滴1N HCL 浸润1min使细胞膜变脆。而后小心将唾液腺转移到另一干净载玻片上 ，或小心将唾液腺周围的垃圾摖干净，然后滴上一滴醋酸洋红染色液，染色10min。4.盖上盖玻片，然后平放在实验桌上，用大拇指压下盖玻片，用力要适当，避免将玻片压碎，又要尽可能地将细胞压散。5.显微镜下观察制好唾液腺染色体的压片。,实验报告： 绘制所观察到的分散较好的唾液腺染色体图像。,实验四：核型分析,实验目的： 了解人类染色体的基本形态特点； 掌握染色体组型分析的各种数据指标； 了解和掌握染色体核型分析的方法。,发展历史,1920年提出三项技术促进：低渗处理 秋水仙素应用 植物凝激素应用染色体分带技术：Q带、G带、R带、 C带、 T带、N带等FISH技术,染色体的特征,数目 （2n=？）长度 （绝对长度、相对长度）着丝粒位置 （MSMSTT）随体与次溢痕的数目、大小和位置带型分析,各类常用实验生物和人细胞DNA含量与染色体数目,染色体超螺旋,染色体观察及核型分析,应用意义,染色体组型分析染色体水平上的表型可确定物种的特征，确定种属亲缘关系分析生物物种的变异和进化过程识别单条染色体、基因定位临床应用（染色体疾病、产前诊断）,人类23对染色体,核型分析方法,对放大的染色体照片进行相关参数的测量臂率长臂/短臂着丝粒指数（短臂/该染色体长度）100相对长度(每条染色体长度/总长度)100总长度该细胞单倍体全部染色体长度之和,核型分析方法,分类 根据臂率值确定染色体着丝粒位置，进而依照着丝粒的位置将染色体分为四类：,核型分析方法,配对 根据测量数据，比较染色体的形状、大小、相对长度、臂比、着丝粒指数、随体的有无等特征，对照片上的染色体进行粗剪和同源染色体配对。排列。将配对的染色体按由大到小的顺序粘贴排列在实验报告纸上，对于等长的染色体，短臂长的排在前面。排列时短臂在上，长臂在下。着丝粒排在同一条直线上。,实验用品,毫米尺、剪刀、胶水、计算器、白纸人染色体放大照片,人中期细胞染色体（染色体数目2N=46）,染色体编号(人X染色体),记述一特定带时，需要写明4个内容：染色体号，长短臂，区的号序和带的号序。这些内容按顺序写，不用间隔或加标点。如果某一带被再细分，在原带号数后加一小数点，编号原则仍按从着丝粒往臂端序贯编号。如1p31.2代表一号染色体短臂3区1带第2亚带,核型描述,首先列出染色体总数，然后是性染色体组成，接着列出异常的染色体数目或形态。下列统一的命名符号：A-G 染色体组的名称1-22 染色体编号X,Y 性染色体del 缺失der 结构重排的染色体dup 重复inv 倒位t 易位+/- 在染色体符号前表示染色体增加或减少，在染色体符号后表示染色体多出或缺少一部分,实验步骤,计数，沿边缘剪下染色体，编号初步目测配对，分组测量长度，计算相对长度、着丝粒指数、 臂比，相同的染色体间配对将配对好的染色体排列并粘贴在纸上，每一组下面画一横线，在两端注明起止号，并在横线下的中部写明A-G组号，染色体从大到小编为1-22号，性染色体单独列为一组,染色体制片技术,骨髓细胞和外周血细胞制片技术直接制片法：直接取骨髓细胞经空气干燥法制片外周血淋巴细胞制片：快速法 先注射秋水仙素-低渗-固定-干燥培养法 取血加植物凝血素培养植物细胞染色体制片技术前处理-酶解去壁-低渗-固定-解离-染色-压片,六、作业及思考题,1.观察人类染色体的形态、结构特点。2. 对比男性和女性的染色体标本，比较异同。,实验目的：,学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术理解同工酶的概念及遗传学意义,实验五：同工酶技术,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂又称为共聚体的，甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyAcrylamide Gel Electrophoresis（PAGE）。 聚丙烯酰胺凝胶的优点：1）化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感；2）重复性好；3）灵敏度高，可达10-6 g；4）分辨率高。,原理：,聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中上层浓缩胶和下层分离胶由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动有： (1)电荷效应； (2)分子筛效； (3)还具有浓缩效应:较厚的蛋白质加样层可以被浓缩成很薄的蛋白质层。 因而分离条带清晰度及分辨率佳。,同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶。 它们是由遗传体系决定的即相同的基因在不同组织中表达的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同.由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的差异，在电泳时条带略有差异,因此可用电泳将它们分离开来。 生物体内存在多种同工酶,其中最经典的是乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase)简称LDH。,试剂：,（）凝胶缓冲液：称取molL HCl 48 mL，Tris（三羟基氨基甲烷）36.6g，TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺）0.23mL，加重蒸水至80mL使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸水定容至100mL，置棕色瓶，4贮存。（2）分离胶贮液：30%Acr-0.8%Bis贮液：丙烯酰胺（Acr）30.0g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加重蒸水使其溶解后定容至100mL。（3）分析纯过硫酸胺（AP）（AR）0.14g加重蒸水至100mL，置棕色瓶，4贮存仅能用一周，最好当天配置。 以上三种试剂用于制备分离胶。（4）浓缩胶缓冲液：称取1mol/L HCl 48mL，Tris 5.98g，TEMED 0.46mL，加重蒸水至80mL，调pH6.7，用重蒸水定容至100mL，置棕色瓶，4贮存。（5）浓缩胶贮液：称Acr 10g，Bis 2.5g，加重蒸水溶解后定容至100mL，过滤后置棕色瓶，4贮存。（6）40%蔗糖溶液（W/V）。 以上（3）-（6）四种溶液用于配制浓缩胶。,器材：,夹心式垂直板电泳槽，凝胶膜，直流稳压电源（电压300-600V，电流50-100mA），吸管，烧杯（25，50，100mL），细长头的滴管，微量注射器，培养皿,图 夹心垂直板电泳槽示意图1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统,操作方法：,1.安装电泳槽2.贮液制备3.制备凝胶板 （1）分离胶制备： 分离胶缓冲液pH8.9Tris-HCl（TEMED）2.50mL；凝胶贮液30%Acr-0.8%Bis 5.00mL；重蒸水2.50mL ；0.14%AP 10mL 混匀后的凝胶溶液倒入玻璃板之间的窄缝内，加胶高度距上端口2cm为止。用注射器在凝胶表面轻轻加上一层重蒸水，用于隔绝空气，使胶面平整。约30min-60min后凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面的界线。倒去上层的重蒸水。 （2）浓缩胶的制备：浓缩胶为pH6.7 2.5%PAA，其配制方法如下： 浓缩胶缓冲液pH6.7 Tris-HCl（TEMED）1mL；浓缩胶贮液10%Acr-2.5%Bis 2mL；40%蔗糖 4mL；0.14%AP 3mL 混合均匀后加到分离胶上方，距短玻璃板上缘0.5cm处。轻轻插入样品槽模板。约2-3小时后凝胶完全聚合，轻轻取出样品槽模板，用滤纸吸去多余的液体，加入稀释10倍的pH8.3的电极缓冲液，使液面没过短玻璃板0.5cm，即可加样。,4.样品制备：取材：鲫鱼若干条，解剖取1.肠、2.眼睛、3.卵、4.肉、5.胆、6.胰、7.鳃、8.肝、9.心脏放入冰箱保存。提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液tris-Hcl(pH=7.0)此溶液需预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之比为：。用玻璃匀浆机冰浴中匀浆。匀浆液离心约分钟，转分钟。取上清液用ul离心管分装，加ul 甘油和ul溴芬蓝混匀即可点样。5.加样： 作为分析用的PAGE加样量仅需几微克。用微量注射器取20 -30L样品，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。我们今天采用的原料是鲫鱼，有9种不同的样品（1.肠、2.眼睛、3.卵、4.肉、5.胆、6.胰、7.鳃、8.肝、9.心脏），各组每个同学记下样品顺序，待所有样品槽都加了样品，即可开始电泳。,6.电泳：将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10mA，待样品进入分离胶时，将电流调至20-30mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶框上缘1cm时，将电流调回到零，关电源取出电泳板，轻轻将一块玻璃板移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。7.染色：将配好的同工酶染色贮存液倒入培养皿中，染色与固定同时进行，使染色液没过胶板，染色30min左右。染色液配制 NAD+（氧化型辅酶） PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐） 1M乳酸钠液（Ph7.0） 0.1M氯化钠 0.5MTris-盐酸缓冲液（pH7.1） NBT（氯代硝基四氮唑蓝 ) 临用前配置，所需体积已标在棕色瓶上？。,参考染色方法： 1、电泳结束