细胞生物学常用技术

五、细胞内分子的示踪技术 用一定的方法显示细胞中的分子,并对其 在细胞内的代谢过程进行追踪. (一)同位素示踪技术 1.原理 同位素: 核外电子数相同 化学性质相同 原子核重量不同 放射性同位素:衰变,2.应用 (1)条件 可检测、可摄入 (2)方法 放射自显影（autoradiography） 蛋白质 - aa DNA - T RNA - U 脉冲标记,A 放射性物质脉冲掺入活细胞B 不同时间取样切片C 暗处曝光D 显影、定影,胰岛素合成分泌过程,(二) 抗体示踪技术,1.抗体 + 荧光染料 光学显微镜 GFP,GFP融合剪切体蛋白,2. 抗体 + 电子致密物 电子显微镜,胶体金抗体标记胰岛素,六、细胞分子生物学技术1.聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction，PCR） 特异性体外DNA扩增技术 利用针对目的基因所设计的一对 特异寡核苷酸引物，以目的基因 为模板，以dNTP为原料，在DNA聚 合酶作用下进行的DNA体外合成技 术。,（1）反应体系：模板链 DNA 聚合酶 dNTP 引物 （primer） （与模板相应序列互补） （2）反应步骤： 变性 94 退火 55 延伸 72,2. Real time PCR 实时定量PCR (荧光定量PCR)通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。,荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量呈线性关系,荧光背景信号阶段,平台期,以反应管中荧光强度达到阈值时所需的PCR反应循环个数（Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。,3.核酸分子杂交 (1) Southern blotting DNA 将凝胶分离的DNA转移到固相支持膜上,然后与存 在于液相中的标记探针进行杂交,以检测特定DNA序 列的技术. (2) Northern blotting RNA,DNA DNA RNA,DNA RNA RNA 特异性探针,A 基因组DNA的消化B 琼脂糖凝胶电泳分离C 转膜 D 杂交E 放射自显影,(3) 原位杂交技术（in situ hybridization） 用核酸探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进 行杂交，以检测特定核酸分子在细胞内原有位置 的方法。,FISH,4.基因转移技术 应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源基因转移到受体菌或细胞内，并使其在细胞内实现转入基因的扩增或表达。 外源基因 细菌 转化 真核细胞 转染,基因扩增蛋白质表达,载体,(1)限制性核酸内切酶 限制性内切酶：识别DNA分子内由48个碱基构成的特定序列的酶，这些酶的识别位点大多是“回文”序列。粘性末端平滑末端,(2) 质粒载体克隆,(3) 克隆基因的表达在细菌中的表达,在动物细胞中的表达,5.抑制基因表达技术 研究基因功能及调控 疾病的防治,RNA干扰技术 将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA导入细胞，使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。,起始阶段： 双链RNA导入细胞 siRNA (21-23) （short interfering RNAs）效应阶段： RNA诱导沉默复合物 RISC 解链 结合mRNA （RNA induced silencing complex） （降解）,Dicer,ATP,基本原理,6.免疫沉淀技术 ( immuno - precipitation,IP)是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象而发展的可以研究蛋白质相互作用的方法。 研究蛋白质相互作用 基本过程 制备细胞裂解液 抗体-凝胶颗粒或磁珠孵育细胞裂解液 沉淀目的蛋白及相互作用蛋白 分析 SDS-PAGE Western blot 质谱,免疫沉淀过程,7.染色质免疫沉淀技术 ( chromotin immunoprecipitation,ChIP)研究蛋白质与DNA相互作用的一种方法，即确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质基本过程 甲醛处理细胞 超声破碎染色质 加入目的蛋白的抗体，形成抗体-靶蛋 白-DNA复合物 沉淀复合物 分析DNA片段-PCR,染色质交联DNA超声处理,DNA/蛋白共沉淀交联解除,目的基因检测,七、质谱技术 通过测定样品（分子被电离汽化）离子的 质/荷比来进行成分和结构分