一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能（课堂PPT）

激光扫描共聚焦显微镜（LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM）,-基本原理及实例应用李真西7-1032015-10,研究生细胞生物学技术,1,2,一种观察工具，需要前面的实验做基础免疫组化、细胞化学、原位杂交、细胞转染,激光扫描共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM,什么是LSCM用来做什么,？,？,2,2020/5/20,它和荧光显微镜的关系？它和电子显微镜的关系？观察的信号如何而来？,激光扫描共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM,3,2020/5/20,激光共聚焦显微镜的原理,第一部分,4,2,泛指将微小(分辨率0.2M)不可见或难见物品之影像放大,而能被观察的工具。,目镜,光源,聚焦旋钮,光阑和聚光器,载物台,物镜,显微镜（Microscope）,5,2020/5/20,用于研究荧光或荧光标记物质的光学显微镜。,荧光显微镜FluorescenceMicroscope,照相装置,光源（汞灯）,标记了荧光的样品,分光镜(长通短反),物镜,6,2020/5/20,共聚焦显微镜成像,物镜,标本,针孔（pinhole）,焦平面,普通荧光显微镜成像,7,2020/5/20,激光扫描共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM,-以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。,激光,针孔的共轭聚焦技术,断层扫描,荧光显微镜系统,8,2020/5/20,荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜激发光源,9,2020/5/20,荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜光学原理,荧光显微镜,激光共聚焦扫描显微镜,10,2020/5/20,分光镜,不在焦平面的发射光,位于焦平面的发射光,物镜,激发光线,激光器,双针孔,光源针孔、检测针孔,双针孔共用物镜的焦点,荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜光学原理,共轭聚焦,移动激光扫描器，逐点扫描,扫描,点光源,11,2020/5/20,荧光显微镜系统,荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜成像原理,激光扫描共聚焦系统,X光机,CT机,12,2020/5/20,普通荧光显微镜,激光共聚焦显微镜,特点：侧面有扫描器接口；装有微量步进马达；装有防振动装置；装有光路转换装置；配高数值孔径的物镜。,荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜基于的平台-显微镜系统,特点：侧面有扫描器接口；装有微量步进马达；装有防振动装置；装有光路转换装置；配高数值孔径的物镜。,13,2020/5/20,激光共聚焦PMT检测器伪彩色灵敏度高光信号-电信号-图像由计算机精确控制图像的合成和输出，同时电信号增加放大倍数。多通道荧光采集一般3个荧光通道和一个透射光通道，分别成像,荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜基于的平台获取图像方式,荧光显微镜目镜或CCD真彩色所见即所得单通道荧光采集,14,2020/5/20,荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜基于的平台获取图像方式,伪彩色,15,2020/5/20,-以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。,激光扫描共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM,将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的高技术设备。,激光/光学显微镜结合，高灵敏度探测器，高性能计算机/图像处理软件相结合的新型高精度显微成像。,16,2020/5/20,激光扫描共聚焦显微镜的优缺点,17,2020/5/20,1957年，MarvinMinsky在他的专利中首次阐明了激光扫描共聚焦显微镜技术的基本工作原理1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面1970年，Sheppard和Wilson推出第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到清晰的图像，至此LSCM技术基本成熟1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜,激光扫描共聚焦显微镜的发展,18,2020/5/20,目前常见的激光共聚焦显微镜,19,2020/5/20,激光共聚焦显微镜构成,扫描器系统,荧光显微镜系统,计算机图像存储与处理系统,ZeissLSM-710ConfocalSystem,激光光源,20,2020/5/20,ZeissLSM-510ConfocalSystem,21,2020/5/20,ZeissLSM-710ConfocalSystem,22,2020/5/20,激光共聚焦显微镜的功能,第二部分,23,2,激光共聚焦显微镜的功能,ZOOM成像,薄层光学切片,荧光定量分析,多维度成像,多通道同时扫描,24,2020/5/20,薄层光学切片,激光共聚焦显微镜的功能,使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰。使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。逐点扫描，形成光学切片,25,2020/5/20,牛肺上皮细胞,展现最清晰成像细节,26,2020/5/20,ByGeorgevonDassow,UniversityofOregon,展现最清晰成像细节,27,2020/5/20,小鼠神经元细胞,高清晰成像,28,2020/5/20,多通道同时扫描,普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。,激光共聚焦显微镜的功能,29,2020/5/20,动脉内皮细胞三标记,30,多重荧光标记,海马DG区,31,2020/5/20,绿色：SYBR14染色，活精子红色：PI染色，死精子,绿色：活菌红色：死菌,牛精子,藤黄微球菌,32,2020/5/20,拟南芥，ByHeitiPaves,CentreofExcellenceENVIRON,Estonia,斑马鱼神经元系统，byAlbertPan，HarvardUniversity,共聚焦绚丽图像,视网膜烟花，byJoshR.Sanes,HarvardUniversity,33,2020/5/20,ZOOM成像,激光共聚焦显微镜的功能,在不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，并进行精细逐点扫描成像，获得高分辨率图像。,共聚焦的优势,34,2020/5/20,ZOOM成像,35,2020/5/20,ZOOM和高分辨率扫描的极限,36,2020/5/20,多维度扫描,通过调节针孔的大小，控制样品扫描层面的厚度，可逐层获得高分辨率的光学横断面图像。并可用计算机软件后期合成去除非交信息的三维立体图像。XYZ扫描XYT扫描,激光共聚焦显微镜的功能,37,2020/5/20,大鼠卵细胞的细胞骨架,38,胚胎的结构,39,单层面扫描多层叠加,切片分层叠加,40,2020/5/20,耳蜗基底膜,41,三维图像重建,42,2020/5/20,三维图像重建,43,2020/5/20,三维图像重建动态观测,44,2020/5/20,荧光定量分析,激光共聚焦显微镜的功能,使用能量稳定的激光作为光源，且各种参数可调。荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。同一个光学条件下，应用相同的荧光探针，通过比对各组样品之间的荧光强度值，进行定量分析。,45,2020/5/20,荧光定量分析,随机圈取细胞，可得到所圈细胞的相对荧光强度值,46,2020/5/20,荧光表达量测定,利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。,47,2020/5/20,细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的水平差异。,48,2020/5/20,激光共聚焦显微镜技术应用,第三部分,如何获得一幅好的图片,49,2,观察的对象荧光（Fluorescence）,荧光：物质吸收能量后所释放出的冷发光现象通常为吸收短波长的能量后发散出长波长的光荧光光谱：激发光谱通过测量荧光物质的荧光发射强度随激发波长变化而获得的光谱。发射光谱荧光物质的荧光发射强度随放射波长变化而获得的光谱。,50,2020/5/20,自发荧光：指组织细胞不经任何荧光染色便能够激发荧光。,免疫荧光：荧光抗体法产生荧光。,观察的对象荧光（Fluorescence）,外源导入荧光蛋白：利用转基因技术将荧光蛋白基因导入细胞里，让其表达融合蛋白而产生的荧光。,组织和细胞中荧光的来源,荧光染色：很多荧光染料与组织细胞作用，能够在光的作用发出特征波长的荧光，借以观察组织细胞的形态结构、化学组成和功能。,51,2020/5/20,GolgiinfixedandpermeabilizedNIH3T3mousefibroblastcellswaslabeledwithgreen-fluorescentAlexaFluor488conjugateofHPAlectin.Filamentousactinwasstainedwithred-orange-fluorescentAlexaFluor568phalloidin.MitochondriawerelabeledwithaprimaryantibodydirectedagainstOxPhosComplexVInhibitorProteinandvisualizedusingfar-red-fluorescentAlexaFluor680goatanti-mouseIgG.Nucleiwerestainedwithblue-fluorescentDAPI.,荧光抗体或荧光染料标记细胞器或亚细胞结构,52,2020/5/20,绿色荧光蛋白（Green-FluorescentProtein，GFP）,活体检测：由于长波能量低,细胞忍受能力强。长时间检测：荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白能力比荧光素强。容易融合：分子量较小,易与目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。可指示外源目的基因表达及沉默内源目的基因表达,238个氨基酸组成。激发波长479nm发射波长508nm,1962年，日本下村修（Shimomure）等首先从维多利亚水母中分离出了GFP。2008年，美国科学家钱永健、马丁沙尔菲和下村修三人因发现GFP而获得诺贝尔化学奖。,衍生物和突变体：BFP、CFP、GFP、RFP、YFP,53,2020/5/20,ThesefusionproteinsemployarangeoffluorescentmoleculesincludingCFP,GFP,mKATE2,RFPandYFP。,各类荧光蛋白作为标签（tag)融合细胞器特异蛋白指示细胞器,54,2020/5/20,荧光探针与荧光标记：采用一定的标记物，使样品中待测物质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这种给样品赋予特征荧光的操作称作荧光标记。,荧光探针的选择,荧光探针的种类：大分子探针细胞器探针核酸探针金属离子探针细胞电位和细胞内pH值探针分子的特殊集团结合探针,55,2020/5/20,荧光探针的选择,选择的依据：根据实验目的确定需要检定的指标；确定可供选择的荧光探针的范围；考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求；考察荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。,标记的荧光需要在不被其他因素的干扰下能被激光共聚焦显微镜系统检测到,56,2020/5/20,荧光探针的选择多重荧光标记,原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。,57,2020/5/20,1.作为亚细胞定位的标记,蛋白定位在哪里呢？,核复染的作用,58,2020/5/20,2.作为整体结构的标记,图中共有多少个细胞？阳性蛋白的表达效率是多少？,59,2020/5/20,荧光探针的选择多重荧光标记,原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。,60,2020/5/20,样品前处理组织切片：切片的厚度4-50mm冰冻切片：优点是易操作，荧光背景低；缺点是容易破坏组织结构，不利于形态观察。石蜡切片：优点是样品易保存，缺点是容易引入干扰荧光。细胞标本：细胞种类和纯度杂细胞的干扰会导致错误实验结果。细胞密度：如果进行形态观察、三维重建、定位荧光信号，细胞密度不低于20；如果是测定荧光强度，细胞约占视野面积的80。承载细胞的器皿：petri皿（又称小皿）：适用面最广，可用于活的或固定的细胞样品。盖玻片：适用于固定的细胞。,样品制备的基本原则,样品前处理-荧光标记-上机观察,61,2020/5/20,样品制备的基本原则,样品前处理-荧光标记-上机观察,荧光标记染料直接染色：生物样品与荧光探针直接作用，使样品具有荧光。免疫荧光：是将抗体标记上荧光素与细胞或组织内相应的抗原结合后，通过观察检测特征的荧光，定性、定位及定量的检测样品中的抗体。表达荧光蛋白：跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋白定位的标记物。,免疫荧光,直接标记：一抗上带有荧光探针,间接标记：二抗上带有荧光探针,62,2020/5/20,样品制备的基本原则,上机观察前的注意事项：尽快上机采集图像，防止荧光泄漏、荧光淬灭及样品干燥等导致的荧光变化。封片：防止样本变形防止荧光褪色用于LSCM的盖玻片厚度应为0.17mm在用激光共聚焦显微镜观察前，先用普通荧光显微镜观察有无信号。,样品前处理-荧光标记-