6-蛋白质化学4-高级结构（课堂PPT）

蛋白质的高级结构超二级结构和三、四级结构,1,黄,复,一级结构：氨基酸序列及二硫键位置二级结构：螺旋，折叠超二级结构(motif,fold)结构域（domain）三级结构：所有原子空间位置四级结构：蛋白质多聚体,蛋白质的结构层次,高级结构,2,黄伟达,复旦大学生物化学系,超二级结构（Supersecondarystructure）,超二级结构是介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构。相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（blockbuilding）。基本形式有、和等。多数情况下只有非极性残基侧链参与这些相互作用，而亲水侧链多在分子的外表面。,3,黄伟达,复旦大学生物化学系,超二级结构类型形成超二级结构的作用力形成超二级结构的作用力-sheet的拓扑学规律,超二级结构SuperSecondaryStructure,4,黄伟达,复旦大学生物化学系,超二级结构的类型,：keratin,myosin、：拥有-sheet的蛋白质,5,黄伟达,复旦大学生物化学系,：螺旋的侧链位置的20度错位：伸展肽链的12.5度自然扭曲,形成超二级结构的作用力,6,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质中的几种超二级结构,Rossman折叠,（螺旋处于折叠片上侧）,发夹,曲折,希腊钥匙拓扑结构,7,黄伟达,复旦大学生物化学系,超二级结构,是一种由两股右手-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋(superhelix)，重复距离约140。是-角蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白(protomyosin)和纤维蛋白原(fibrinogen)中的一种超二级结构。每圈螺旋为3.5个氨基酸残基（不是3.6），沿轴有一定的倾斜，重复距离从5.4缩短到5.1。螺旋之间的相互作用由侧链的装配控制，螺旋之间可能作用的侧链是非极性的，它们向着超螺旋内部，避开与水接触，其他的是极性的，处于分子的表面，与水接触。超螺旋的稳定性主要由非极性侧链间的范德华力相互作用的结果。,8,黄伟达,复旦大学生物化学系,细胞色素C的结构,是一种螺旋束，经常是由两股平行或反平行排列的右手螺旋段相互缠绕而成的左手卷曲螺旋或称超螺旋。螺旋束中还发现有三股和四股螺旋。卷曲螺旋是纤维状蛋白质如角蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白的主要结构元件，也存在于球状蛋白质中。,9,黄伟达,复旦大学生物化学系,肌球蛋白（Myosin）,肌球蛋白是一种马达蛋白(motorprotein)，在肌肉收缩和细胞分裂中起重要作用。Mr550000，6个亚基：2条重链(Mr200000)，4条轻链(2L218000，L116500，L325000)，状如“Y”字，长约160nm。在肌球蛋白超家族中，头部区域都有相当高的同源性，特别是ATP和肌动蛋白的结合位点非常保守，头部具ATP酶活性。两条重链的氨基末端分别与两对轻链结合，形成两个球状的头部和颈部调节结构域，称为S1(subfragment1)，余下重链部分组成肌球蛋白长杆状的尾部。,10,黄伟达,复旦大学生物化学系,11,黄伟达,复旦大学生物化学系,Meromyosin:酶解肌球蛋白,12,黄伟达,复旦大学生物化学系,折叠在蛋白质中的不同形式,13,黄伟达,复旦大学生物化学系,超二级结构,最简单的组合是由二段平行的-链和一段-螺旋链组成。最常见的组合Rossmann折叠。,超二级结构,-曲折和回形拓扑结构是（）组合的两种超二级结构。-曲折(mander)：相邻的三条反平行-链通过紧凑的-转角连接而成。,14,黄伟达,复旦大学生物化学系,在蛋白质中(Rossmann折叠),15,黄伟达,复旦大学生物化学系,细胞核抗原的结构,16,黄伟达,复旦大学生物化学系,理论上四条折叠有12种组合，但是,17,黄伟达,复旦大学生物化学系,Greekkey的由来,回形拓扑结构，反平行-折叠片中常出现的超二级结构，这种结构直接用希腊陶瓷花瓶上的一种常见图案命名，称为“Greekkey”拓扑结构。有两种可能的回旋方向，实际上只存在一种，什么基础还没有确定。,18,黄伟达,复旦大学生物化学系,-桶,19,黄伟达,复旦大学生物化学系,-螺旋桨,20,黄伟达,复旦大学生物化学系,-sheet形成的结构,21,黄伟达,复旦大学生物化学系,纤溶酶原的结构,22,黄伟达,复旦大学生物化学系,锌指结构(螺旋-折叠-折叠模序),转录因子MyoD的螺旋-环-螺旋模序,23,黄伟达,复旦大学生物化学系,结构域(Domain),也称辖区，空间上相对独立，是进化过程中不同基因融合的结果。结构域是在二级结构或超二级结构的基础上形成的三级结构的局部折叠区，一条多肽链在这个域范围内来回折叠。通常由50-300个氨基酸残基组成，其特点是在三维空间可以明显区分和相对独立，并且具有一定的生物学功能。基序（motif）是结构域的亚单位，通常由2-3个二级结构单位组成，一般为螺旋、折叠和环（loop）。,24,黄伟达,复旦大学生物化学系,25,黄伟达,复旦大学生物化学系,免疫球蛋白中的结构域,26,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质的三级结构(Tertiarystructure),27,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质每个原子的空间位置。蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构，称为蛋白质的三级结构。或指蛋白质分子主链折叠盘曲形成构象的基础上，分子中的各个侧链所形成一定的构象。侧链构象主要是形成微区(或称结构域domain)。对球状蛋白质来说，形成疏水区和亲水区。疏水区常形成一些“洞穴”或“口袋”，某些辅基就镶嵌其中，成为活性部位。主要研究方法是X-光衍射和核磁共振法。,28,黄伟达,复旦大学生物化学系,29,黄伟达,复旦大学生物化学系,维持蛋白质三级结构的作用力,30,黄伟达,复旦大学生物化学系,31,黄伟达,复旦大学生物化学系,X-射线衍射，通过对材料进行X-射线衍射，分析其衍射图谱，分析材料的成分等。,X-射线（光）衍射（X-RayDiffraction,XRD）,32,黄伟达,复旦大学生物化学系,X-射线(X-ray),X-射线是一种波长很短的电磁辐射，其波长约为(20-0.06)10-8cm之间。伦琴射线具有很高的穿透本领，能透过许多对可见光不透明的物质，如墨纸、木料等。这种肉眼看不见的射线可以使很多固体材料发生可见的荧光，使照相底片感光以及空气电离等效应，波长越短的X射线能量越大，叫做硬X射线，波长长的X射线能量较低，称为软X射线。,33,黄伟达,复旦大学生物化学系,X射线衍射原理,34,黄伟达,复旦大学生物化学系,产生原因,晶体由有序排列的质点组成，当x-ray与质点相遇时，首先被晶体各个原子中的电子散射，每个电子都是一个新的辐射波源，其波长与原射线相同。原子在晶体中是周期排列，散射波之间存在着固定的位相关系，它们之间会在空间产生干涉。衍射：原子在晶体中的周期性排列使得x-ray散射在一些特定的方向加强，而在其它方向减弱的现象。x-ray衍射实质：大量原子散射波互相干涉结果。散射是衍射的基础，而衍射则是晶体对x-ray散射的一种特殊表现形式，并非x-ray与物质相互作用的新现象。,35,黄伟达,复旦大学生物化学系,X-射线的衍射,x-ray射入样品，其背后放置照相底片。非晶体：沿x-ray传播方向形成一个斑点。晶体：除透射束形成的中心斑点外，周围还有有规律分布的其它斑点。说明有偏离原入射方向的x-ray存在。x-ray遇到晶体后所产生的上述现象称为x-ray的衍射，偏离原入射方向的射线称衍射线，底片上出现的图形称衍射图，图上的斑点称衍射斑点。利用x-ray研究晶体结构中各类问题，主要是通过x-ray在晶体中产生的衍射现象进行的。,36,黄伟达,复旦大学生物化学系,1895:W.C.RoentgendiscoveredXrays.1912:MaxvonLauediscoveredX-raydiffractionbycrystals.1913:W.L.BraggreportedthecrystalstructureofNaCl,providingthefirstexperimentalevidencefortheabsenceofsaltmolecules.1928:KathleenLonsdalereportedthestructureofbenzeneashavingsixequalsizedbondsinsteadofalternatingdoubleandsinglebonds.1935:J.M.Robertsonetal.solvedthestructuresofphthalocyanines（苯二甲素颜料）,thefirstcaseofacomplexorganicmoleculesolvedindependentlybycrystallography.1948:Bijvoetetal.solvedstrychnine(士的宁，左旋肉碱酒石酸盐）,perhapsthefirstcaseinwhichcrystallographydecidedbetweenalternativesproposedbyorganicchemists.1950:Bijvoetetal.establishedtheabsoluteconfigurationsofdextroandlaevocompoundswithNaRbtartrate.1949-57:DorothyCrowfootHodgkinetal.solvedthestructuresofpenicillin(1949)andvitaminB-12(1957).ShewontheNobelPrizeinChemistryin1964.,X-RAYDIFFRACTION技术的历史,37,黄伟达,复旦大学生物化学系,X-RAYDIFFRACTION研究蛋白质的立体结构,1936年MaxF.Perutz开始用X-光衍射技术来研究血红蛋白的立体结构；1945年Perutz的学生J.C.Kendrew开始研究肌红蛋白的结构；1957年肌红蛋白的结构确定,1959年血红蛋白结构解明；两人于1962年获得诺贝尔化学奖。,38,黄伟达,复旦大学生物化学系,Kendrew,Perutz,L.Braggs,39,黄伟达,复旦大学生物化学系,Laboratoryprocedure,Musthaveapurifiedprotein(ornucleicacid)MustbeabletocrystallizethismoleculeintoacrystalfromthatisstabletoirradiationbyX-raysMountthecrystalintheX-raymachineCollectdiffractedradiationonfilmorintoanarrayofdetectorsUseacomputertocarryoutFouriertransformsonthisdensitydataFromthesespots(reflections)andtheFouriertransform,acontourmapofelectrondensityiscreatedAnactualphysicalmodelisthenconstructedsoastoplacethenucleiofeachofthenon-hydrogenatomsinthecenterofoneofeachoftheareasofhighelectrondensity(originallydonebyhandisnowdonebycomputer).Inadditiontotheimmenseamountofworkrequired,PerutzandKendrewfacedtwomajorproblemsthathadtobesolvedinordertoobtainastructure:A.Thephasedetermination(i.e.whatisupanddown).Thiswasachievedbytheprocessofheavyatom(UorPb)replacement.B.Obtainingadequatecomputerpowerforthemassivenumberofcomputations,theFouriertransformcalculations.ThefirstelectroniccomputerswerenotdevelopeduntilafterWorldWarII.,40,黄伟达,复旦大学生物化学系,By1957,Kendrewhadmeasured400reflections,andfromthem,createdastructureformyoglobinatthelevelof0.6nmresolution.(Noindividualaminoacidresidueswerevisible)Laterheanalyzed9600reflectionstoproduceadensitymapat0.2nmresolution.Finally,in1962heanalyzed25,000reflectionstoproduceadensitymapat0.14nm.Resolutionofthislevelallowedassignmentof1200ofthe1260non-hydrogenatoms.TodaythetechniqueofX-raycrystallographyhasbeenrefinedsuchthatpreparingrobustcrystalsoftheappropriatesizeisthemostdifficulttaskinobtainingamolecularstructure.Theadventofarraysofdetectorsconnecteddirectlytopowerfulcomputers,permitsthegenerationofmolecularstructuresonthecomputerdisplayinamatterofweeks.,41,黄伟达,复旦大学生物化学系,核磁共振是确定蛋白质分子在溶液中的动态结构的唯一方法,KurtWuthrich，瑞典科学家2002年获得诺贝尔奖,42,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质几种不同的立体结构表示法,43,黄伟达,复旦大学生物化学系,胰岛素的三级结构,44,黄伟达,复旦大学生物化学系,溶菌酶的三级结构,45,黄伟达,复旦大学生物化学系,磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构,-折叠形成内桶和-螺旋组成的外桶,46,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质的四级结构,蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质与核酸的相互作用，比较简单的体系有血红蛋白、限制性内切酶等，复杂体系有核糖体、病毒、肌肉蛋白等。,47,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质的四级结构（Quaternarystructure),指蛋白质分子中亚基的立体排布，亚基间的相互作用与接触部位的布局。亚基(subunit)就是指参与构成蛋白质四级结构的、每条具有三级结构的多肽链。单条多肽链组成的蛋白质分子没有四级结构；一般是一条多肽链形成一个亚基。亚基可相同或不同。亚基单独存在无活性；维系蛋白质四级结构的是氢键、盐键、范氏引力、疏水键等次级键。,48,黄伟达,复旦大学生物化学系,血红蛋白(hemoglobin)的四级结构,寡聚蛋白质，四个亚基，两个（141AAs)两个(146AAs），四个亚基占据四面体的四个角。血红素辅基位于分子表面的空穴里，每个亚基一个辅基。四个氧的结合部位保持一定距离。每个链与每个链接触，同亚基间很少有作用。,49,黄伟达,复旦大学生物化学系,DNA和蛋白质的相互作用也是四级结构,50,黄伟达,复旦大学生物化学系,病毒是巨大的蛋白质四级结构复合体,51,黄伟达,复旦大学生物化学系,核糖体，蛋白质和核酸的复合体,52,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质的一级结构决定高级结构,53,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质从伸展的多肽链形成其特定的立体结构的过程叫折叠（folding）。维持其特定的立体结构的作用力为：氢键、疏水作用、范德华力、离子键和配位键。多数蛋白质被合成以后，自己就能形成自由能最低的立体结构。,54,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质的一级结构决定其高级结构。换言之，蛋白质的三维立体结构完全取决于其氨基酸的序列。蛋白质的天然立体结构一般是自由能最低的状态。Anfinsen（1972诺贝尔奖获得者）用极其简单的实验证明了蛋白质的一级结构决定其高级结构。,55,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质的一级结构决定高级结构Anfinsen的实验,56,黄,复,Anfinsen的实验（续）,可恢复到原活力的95-100%,重新形成的四对二硫键与原来的完全一致,57,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质以多肽链的形式被合成出来后，要形成特定的立体结构后才有生理活性。拥有生理活性的立体结构对每种蛋白质而言，是特定和唯一的，通常称之为天然结构（nativestructure）。蛋白质的天然立体结构在溶液中有一定的可塑性（弹性）。,58,黄伟达,复旦大学生物化学系,有些蛋白质被合成以后，自己不能独立形成自由能最低的立体结构。大多数蛋白质的正确折叠还需要其他分子的帮助：分子伴侣（molecularchaperone)和折叠酶。分子伴侣普遍存在于真核生物和原核生物中，一般使用ATP的能量帮助其它蛋白质形成自由能最低的立体结构，但不改变自己。,59,黄伟达,复旦大学生物化学系,60,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质在受热或在高浓度的尿素、盐酸胍等化学试剂存在下会丧失活性，该现象称为蛋白质的变性（denaturation）。蛋白质变性的的化学本质是高级结构的破坏（一级结构不被破坏），特别是氢键的破坏。有些蛋白质的变性是可逆的，以适当的方法（如透析）将变性剂除去，蛋白质可恢复其天然立体结构，该过程称为复性（renaturation）。,61,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质结构形成总则,62,黄伟达,复旦大学生物化学系,一、蛋白质的形状分球状和纤维状；稳定的蛋白质结构倾向于拥有最多量的氢键；二、球状蛋白质都有疏水核心，由疏水侧链构成，亲水侧链分布在蛋白质的表面或酶活性中心（油滴法则），蛋白质的内部不得有空隙；纤维状蛋白也符合这一规律；三、多聚体化是球状蛋白质的普遍现象，不正常聚合成纤维状可导致疾病；四、穿膜区一定呈螺旋结构，侧链外露。,63,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质的折叠过程很象左图中的绳子自然落下的过程，不会出现右图中的“打结”现象。,64,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质结构与疾病,65,黄伟达,复旦大学生物化学系,生物体内的每一个基因均受到来自生物演化的选择压力，其结果是每个蛋白质均有其独特（和唯一的）的立体的结构和生化生理功能。蛋白质立体结构的改变可能引起人类或动物的疾病。,蛋白质立体结构的特定和唯一性,66,黄,复,库鲁病克-雅二氏症疯牛病,20世纪末，人们最害怕的动物是牛-从英格兰蔓延出来的疯牛病。1985-4-25，英国农场原本温顺安静的乳牛变得有攻击性、紧张、动作失调。宰杀后作为饲料，18个月后，该农场又有7头母牛生病死亡。1987，疯牛病蔓延到英格兰和威尔士各地农场的牛群。1995年5月一只猫的死亡(症状与牛一样）引起了全国性恐慌，4年内死了62只猫。1993年，两名英国奶农死于克-雅二氏病。库鲁病（新几内亚）仅发生于妇女和儿童（步态紊乱-颤抖-手足失济-瘫痪-不能吞咽-饿死或渴死），但头脑清楚、没有炎症。脑中有大量淀粉样蛋白（amyloid)。1730最早报道的神秘疾病-羊瘙痒症，19世纪大流行，20世纪只是一种地方性疾病。1963年，研究发现库鲁病的传播与富雷人食人有关（食用尸体是妇女和儿童的特权，所以男人很少得库鲁病），1965证实是一种传染病，且能跨种传播。,67,黄伟达,复旦大学生物化学系,朊病毒（Prion）,也称传染性蛋白粒子/朊粒/朊病毒。是一种不同于细菌、病毒或类病毒的在分类上尚未定论的病原因子。其本质为由正常宿主细胞基因编码的、构象异常的蛋白质，称为朊蛋白(prionprotein,PrP)，目前尚未检出任何核酸成分，是人和动物的传染性海绵状脑病(transmissiblespongiformencephalopathies,TSEs)的病原体。,68,黄伟达,复旦大学生物化学系,一条肽链对应一个特定的空间结构，这条法则的破坏是灾难性的。导致疯牛病的prion就是一个例子。,正常prion,异常prion,1982年，美国学者Prusiner提出用proteinaceousinfectionparticle的字头组成Prion一词，作为TSE的病原。因此荣获1997年Nobel医学奖。1996年底美国Nature评出最有影响的十大科研成果中，“成功发现PrPsc是疯牛病和人CJD的病因”为第四条。,69,黄伟达,复旦大学生物化学系,Prion是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白，分子量为27-30103，因此又称为PrP27-30。两种不同的分子构型：细胞朊病毒蛋白(cellularPrP,PrPC)：三维结构具有42%的-螺旋，3%的折叠。存在于正常组织及感染动物的组织中，是正常基因的产物，通常情况下是无害的。对蛋白酶K敏感。羊痒疫朊病毒蛋白(scrapieprionprotein,PrPSC)：-螺旋占30%，折叠高达43%，仅存在于感染动物的组织中，与致病和传染有关。对蛋白酶K有抗性。,70,黄伟达,复旦大学生物化学系,Prion在病理组织中的纤维状聚合体,中枢神经细胞空泡化、弥漫性神经细胞缺失、胶质细胞增生、淀粉样斑块形成、脑组织海绵状改变等。痴呆、共济失调、震颤等中枢神经系统症状。,71,黄伟达,复旦大学生物化学系,人和动物prion病,72,黄伟达,复旦大学生物化学系,1.羊瘙痒病(scrapieofsheepandgoat)：在欧洲已流行了近300年（第一个被发现的TSE）,感染动物表现为消瘦、步态不稳、脱毛、麻痹等，因病羊由于瘙痒而常在围栏上摩擦身体而得名，病死率极高。,2.牛海绵状脑病(bovinespongiformencephalopathy,BSE):俗称疯牛病(madcowdisease):1986年首次在英国报道。该病潜伏期45年，发病初期表现为体质变差，体重减轻，产奶量下降等非特异性症状。随后神经系统症状逐步明显，出现运动失调、震颤等，由于病牛常表现出感觉过敏、恐惧甚至狂乱，因此俗称“疯牛病”。,73,黄伟达,复旦大学生物化学系,3.库鲁病(Kurudisease):仅发生在巴布新几内亚东部高地的土著人中的一种进行性小脑退行性疾病。本病以寒战样震颠为突出的临床表现而得名。潜伏期漫长(4-30年)，发病大多在6-9个月内死亡。以小脑共济失调为主要临床特征，患者早期出现发抖、震颤、发音困难、舞蹈症及肌阵挛等。晚期发展为痴呆，肢体完全瘫痪，最终因吞咽困难、衰竭、感染而死亡。4.克-雅病(Creutzfeld-Jakobdisease,CJD):人的传染性海绵状脑病。散发性患者病因不明，家族性CJD患者的prion基因常发生变异。医源性因素主要与医疗器械消毒不严、脑深部电极、角膜移植、器官移植或注射从尸体脑垂体提取的生长激素、促性腺激素等因素有关。我国也有报道。潜伏期15m-40y。临床表现为迅速进展的痴呆，肌阵挛，皮质盲，小脑共济失调，运动性失语，并迅速发展为半瘫、癫痫甚至昏迷，病人最终死于感染或自主神经功能衰竭，约90%的患者于1年内死亡。病理特征与库鲁病相似，以神经细胞变性、减少或消失，空泡形成，海绵状改变及出出淀粉样斑块为主。其中海绵状空泡化被认为是CJD的特征病理诊断依据。,74,黄伟达,复旦大学生物化学系,5.克-雅病变种(variantCJD,v-CJD)：一种新型的人类传染性海绵状脑病，1996年由英国CJD监测中心首次报导。本病与典型的CJD在好发年龄、临床特征、脑电图和病理等方面有明显变化，因此被认为是新变种(newvariantCJD,v-CJD)。进一步的研究结果显示，从这些病例中提取的PrPSC与来源于BSE的PrPSC的性质相同，患者脑组织的病理变化与BSE相似，从而表明v-CJD与疯牛病密切相关。现在普遍认为v-CJD的来源可能是人食物链中含有疯牛病的致病因子所致，但确切的致病机制尚不清楚。BSE和v-CJD的出现已受到国际社会的广泛关注。,75,黄伟达,复旦大学生物化学系,Thefirstthree-dimensionalstructureofabiopolymerwastheDNAmodelbuiltbyJ.D.WatsonandF.H.C.Crickin1953takingintoaccountfiberdiffractiondataprovidedbyM.H.F.Wilkinsandothers(NobelPrizeinPhysiologyorMedicine,1962).HereisacopyoftheoriginalpapersubmittedtoNatureonApril2,1953andpublishedonApril25,1953.Thefirstthree-dimensionalproteinstructures(myoglobinandhemoglobin)weredeterminedbyM.F.PerutzandJ.C.Kendrew(NobelPrizeinChemistry,1962).TheentriesincludedinthePDB(PDBcodes:1mbnand2dhb)representrefinedstructures.J.C.Kendrewhadobtainedamyoglobinstructureataresolutionof6?alreadyin1957.A.Klughascontributedsubstantiallytothedevelopmentofelectronmicroscopy.Thismethodissuitableforsystemsthatcannotbecrystallized(NobelPrizeinChemistry,1982).A.Klughasappliedthismethodprimarilytovirusstructures(seeforexample,Finch,Klug,J.Mol.Biol.1965,13,1-12).Thestructureofthefirstmembrane-boundprotein(aphotosyntheticreactioncentre;PDBcode:1prc)wasresolvedbyJ.Deisenhofer,R.HuberandH.Michel(NobelPrizeinChemistry,1988).Thefirstthree-dimensionalproteinstructuredeterminedbyNMRspectroscopy(proteinaseIIainhibitorfrombullseminalplasma(PDBcodes:1bus,2bus)wasreportedbyK.Wthrichandco-workersin1985(NobelPrizeinChemistry,2002).,研究生物大分子历史上“第一”们,76,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质的结构与功能,77,黄伟达,复旦大学生物化学系,为什么研究蛋白质的结构与功能,对蛋白质结构和作用机理的深层次理解对蛋白质结构进行改造的基础对蛋白质功能的控制“随心所欲”创造具有新功能的蛋白质,78,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质的一级结构与构象、功能的关系,蛋白质一级结构是空间结构的基础，特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持，可根据一级结构的特点自然折叠和盘曲，形成一定的空间构象。蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使有一个残基发生异常，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响。“分子病”镰刀状红细胞性贫血，仅仅是574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基(亚基N端的第6号Glu残基)发生了变异所造成的，这种变异来源于基因上遗传信息的突变。,79,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质的一级结构与功能的关系,由较短肽链组成的蛋白质一级结构，其结构不同，生物功能也不同.由较长肽链组成的蛋白质一级结构中，其中“关键”部分结构相同，其功能也相同；“关键”部分改变，其功能也随之改变。,80,黄伟达,复旦大学生物化学系,一级结构是空间构象的基础。蛋白质一级结构决定空间构象，即一级结构是高级结构形成的基础。只有具有高级结构的蛋白质才能表现生物学功能。一级结构是功能的基础。一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象和功能也相似。相似的一级结构具有相似的功能，不同的结构具有不同的功能，即一级结构决定生物学功能。,81,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质一级结构的种属差异与分子进化。蛋白质氨基酸的序列包含重要的生物进化信息。不同种属来源的同源蛋白质的一级结构存在种属差异。蛋白质的一级结构与分子病。蛋白质的氨基酸序列改变可以引起疾病，人类有很多种分子病已被查明是某种蛋白质缺乏或异常。这些缺损的蛋白质可能仅仅有一个氨基酸异常-分子病。,82,黄伟达,复旦大学生物化学系,同源蛋白质(不同生物中行使相同或相似功能的蛋白质）一级结构的种属差异性细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。通过数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明：（1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性（相似性）越大。不同生物与人的细胞色素C相比较，AA差异数目黑猩猩0鸡、火鸡13牛猪羊10海龟15狗驴11小麦35粗糙链孢霉43酵母菌44（2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变。,83,黄伟达,复旦大学生物化学系,84,黄伟达,复旦大学生物化学系,蛋白质高级结构与功能的关系,变构效应：蛋白质与配基结合后改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象。变构蛋白：蛋白质分子中不止有一个配基的结合部位（活性部位），还有别的配基的结合部位（别构部位）。变构蛋白都有变构效应。变构蛋白一般都是寡聚蛋白质。,85,黄伟达,复旦大学生物化学系,86,黄伟达,复旦大学生物化学系,87,黄伟达,复旦大学生物化学系,（1）肌红蛋白的功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。（2）肌红蛋白的结构特点：a.一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17600。b.整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段-螺旋体（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。,肌红蛋白的结构与功能,88,黄伟达,复旦大学生物化学系,肌红蛋白的结构,89,黄伟达,复旦大学生物化学系,血红素（铁卟啉）辅基的结构及其氧合部位,90,黄伟达,复旦大学生物化学系,肌红蛋白的氧合曲线,Y=,Mbo2,Mbo2+Mb,(Y代表在给定的氧压下肌红蛋白的氧饱和度),Y=,PO2,K+PO2,（1）,（2）,由（1）可见：Y=1时，表明所有肌红蛋白的氧合位置均被占据，即肌红蛋白为氧饱和。由（2）可见：Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，PO2=K解离常数为肌红蛋白一半被饱和时的氧压。,Po2,Y,1.0,0.5,1020304050,91,黄伟达,复旦大学生物化学系,血红蛋白的结构、功能及镰刀形贫血病,92,黄伟达,复旦大学生物化学系,（1）血红蛋白的功能：存在动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH。（2）血红蛋白的结构特点：a.四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000；b.成人的血红蛋白为22；c.链由141AA残基组成，链由146AA残基组成。四个肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。,93,黄伟达,复旦大学生物化学系,血红蛋白含有四条肽链，每一条肽链各与一个血红素相连接。血红素同肽链的连接是血红素的Fe原子以配位键与肽链分子中的组氨酸咪唑基的氮原子相连。,94,黄伟达,复旦大学生物化学系,血红蛋白（Hemoglobin,Hb),Hb(Mr64500)几乎呈球形(d=5.5nm)，四聚体，血红蛋白的四级结构显示了不同亚基间强的相互作用。11界面(22)间存在强相互作用，即使用尿素处理，得到的是完整的二聚体，界面间是明显的疏水作用，但也存在许多氢键和一些离子对作用。,95,黄伟达,复旦大学生物化学系,96,黄伟达,复旦大学生物化学系,结合氧后引起结构改变,血红蛋白有两个主要的构象：R态(relaxed)和T态(tense)，氧可以与两种状态结合，但对R态的亲和力更大。无氧结合时，Hb的四条链之间结合紧密，为T态构象。这种紧密是由离子对作用（12及21界面间）和BPG（2,3-二磷酸甘油酸，位于两条链之间）造成的。氧与Hb一个亚基的T态结合，构象改变为R态。整个蛋白质发生这样的构象改变，单个亚基的结构几乎没有改变。但亚基对相互滑动和旋转，使得亚基间的口袋变窄。这一过程中，稳定T构象的一些离子对被打破，同时产生一些新的离子对。,97,黄伟达,复旦大学生物化学系,98,黄伟达,复旦大学生物化学系,与氧结合时血红蛋白的变构过程,1.血红素中铁原子的变化,99,黄伟达,复旦大学生物化学系,结合氧的血红素附近的构象变化。MaxPerutz假定TR的转变是由于血红素周围几个关键氨基酸侧链位置的改变所引起的。T态的血红素轻微皱褶，引起血红素铁突出His的侧链。氧的结合引起血红素呈现更平坦的构象，将His侧链改变而接触F螺旋。,100,黄伟达,复旦大学生物化学系,101,黄伟达,复旦大学生物化学系,2.亚基三级结构及整个蛋白质四级结构的变化,铁原子的位移F8His的位移使F螺旋、EF拐角及FG拐角发生位移F螺旋向H螺旋移动氢键断裂导致四级结构的盐桥破坏挤出BPG（2,3-二磷酸甘油酸）分子。,脱氧血红蛋白与氧合血红蛋白构象的转变TR,紧张态松弛态,构象紧密构象松弛氧亲和力低氧亲和力高,氧亲和力：指血红蛋白对于氧的结合牢固程度。（在一定氧分压下，氧亲和力越高，即氧结合越牢固。相反，氧亲和力越低，组织就能得到更多的氧供应）,102,黄伟达,复旦大学生物化学系,血红蛋白输氧功能和构象变化,103,黄伟达,复旦大学生物化学系,S形（协同）结合曲线。可以看成反映低亲和与高亲和状态转变的杂合曲线。表明血红蛋白在组织和肺之间对氧浓度微小差异更为敏感，使得血红蛋白在高氧分压的肺中能够结合氧，在低分压的组织释放出氧。,104,黄伟达,复旦大学生物化学系,pH对氧与血红蛋白结合的影响。肺中血液的pH为7.6，组织的血液pH为7.2，实验测定血红蛋白与氧结合在pH7.4。,105,黄伟达,复旦大学生物化学系,H+、CO2的影响：1914年，C.Bohr发现，高浓度的H+和CO2促使氧合血红蛋白分子释放O2，而高浓度的O2促使脱氧血红蛋白