分子杂交技术hu

第十章 分子杂交技术,分子杂交（molecular hybridization）是用一个DNA单链或RNA单链与另一被测DNA单链形成双链，以测定某特异顺序是否存在。,Basic Principle,Denature,Hybridize,Southern, Fish,PCR,Protein: Antigen-antibody interaction,DNA: denaturation and hybridization of the helix structure,第十章 分子杂交技术,第一节 分子杂交第二节 核酸杂交简史与原理第三节 核酸探针标记的方法第四节 核酸分子杂交因素第五节 几种常见的杂交第六节 其他类型杂交介绍第七节 原位杂交,第一节 分子杂交,1.1 原位分子杂交（in situ hybridization）1.2 斑点杂交（dot blotting）1.4 Northern hybridization1.5 Western blotting1.6 电镜观察,1.1 原位分子杂交（in situ hybridization）原位分子杂交有两种:玻片原位杂交膜上原位杂交,玻片原位杂交一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等;片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性，然后再加入探针让其复性，将没有结合的探针充分洗脱；若是同位素标记探针，就须在片子涂一层乳胶或复盖上一张同样大小X光片进行放射自显影，然后观察同位素的爆光点在组织细胞或染色体上的相对位置。如用荧光标记可用荧光显微镜直接观察。,膜上分子杂交将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上（以前用硝酸纤维膜），这种膜只吸附单链DNA。将影印好的膜用NaOH处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可使DNA变性吸附在膜上；然后用无关的单链DNA，如常用小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA吸附到膜上的空白处，称预杂交，防止探针被吸附在背景上，干挠实验结果。膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。,1.2 斑点杂交（dot blotting）也叫狭缝杂交。是由Southern blot衍生而来。方法是将某种生物的总DNA直接点滴在尼龙膜上，或者通过一个小的长形狭缝印在尼龙膜上，将后将膜变性处理，预杂交后，经中和、洗脱、干燥。再将其和探针放入复性缓冲溶液中缓缓复性，洗涤干燥后进行放射自显影，观察结果。这种方法是用来初步探测某种生物中含有一种特殊的基因或顺序。来分析DNA样品之间的同源性。此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要进一步做Southern blotting加以验证。,1.3 Southern blotting该技术是Southern，E.M于1975年首先建立的，故称为Southern杂交，该方法经Southern印迹法将胶上的电泳条带吸印尼龙膜上，然后和DNA探针杂交。用这种方法可以制作染色体的物理图谱，限制性片段长度的多态性，及动物园吸印（Zoo blot）（用一个物种的DNA探针和别种动物的DNA进行Southern blotting）等。,1.4 Northern hybridizationNorthern杂交的技术和Southern杂交相似，作者并不姓“Northern”，因“Southern”意为“南方”，故戏称自己的分析方法为“北方”“（Northern）杂交。Northern 杂交与Southern杂交主要的不同之处在于检验RNA，而不是DNA。首先是提取某种生物或组织的总RNA或mRNA，然后用含有变性剂的琼脂糖凝胶电泳分离RNA，变性剂的作用是防止RNA自我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰实验结果。电泳分离后再将凝胶上的RNA带吸印到尼龙膜上，在液相中和标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基因表达的时空特异性。,1.5 Western blotting既然有了“南方”杂交，“北方”杂交，那么随之而来的就是“西方”杂交（Western blotting），但Western blotting和前面的几种杂交都不相同，它是用来测蛋白而不是检测核酸。此法是由电场的作用将聚丙烯酰胺的电泳胶上的蛋白质带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定蛋白质技术。,1.6 电镜观察先进行分子杂交，再通过电镜观察可以进行基因定位，内含子的探测以及缺失的确定等。断裂基因就是用这种方法发现的。电镜观察有二种，一是异源双链定位法（Heferoduplex mapping），二是R-环定位法（R-loop mapping）将异源DNA双链变性后进行分子杂交，然后制片在电镜下观察，可发现环形不配对的部分，表明可能存在缺失。R-环法是将标记的mRNA和变性后的待测双链DNA进行杂交，制片后，可以观察到R-环，这是由于RNA形成的双链比原来的DNA双链更为稳定，将一条DNA单链置换了出来，表明该mRNA基因就位于R-环这个位置。,第二节 核酸杂交简史与原理,2.1 核酸杂交技术简史2.2 核酸杂交原理,2.1 核酸杂交技术简史1961年，Hall等开始进行探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。开拓了核酸杂交技术的研究。1962年，Bolton等设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。用放射性标记的短DAN或RNA分子与胶中DNA杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针。在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。, 上世纪60年代中期，Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。如Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。RNA在代谢过程中被3H尿嘧啶标记，并在过量的情况下与膜上固定的基因组DNA杂交，继而用RNase处理，消化非特异性结合的RNA。漂洗后计数以测定杂交探针的量。通过计算与已知量DNA杂交的RNA量即可评估rRNA基因数。由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它特异基因的表达，这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实验的基础。,上世纪60年代末，Britten等设计了另一种分析细胞基因组的方法。研究液相中DNA的复性以比较不同来源核酸的复杂度，从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt）的片段。剪切的DNA液，经煮沸使dsDNA热变性成ssDNA。然后冷至约60，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的UV260nm的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。该实验可比较不同来源生物DNA的复性速率，并可建立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。,进入70年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。例如：对特异基因转录产物的分析和对动力学杂交实验的研究。固相化的Poly U Sepharose和寡（dT）-纤维素使人们能从总RNA中分离Poly A+ RNA。用mRNA的经纯化技术可从网织红细胞总RNA中制备-和-珠蛋白mRNA混合物。这些珠蛋白mRNA首次被用于合成特异的探针以分析珠蛋白基因的表达。由于制备cDNA探针很繁琐，所获得cDNA的长度和纯度也不稳定。所以寻求新的探针来源是使分子杂交技术进一步推广的基础。,70年代末期到80年代早期，分子生物学技术有了突破性进展。限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体DAN载体的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA文库和cDNA文库中获得特定基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针DNA。迄今为止，已克隆和定性了许多特异DNA探针。,由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18100个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA就可分析特异基因。特异DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印迹和Northern印迹来测定，与以前的技术相比，大大提高了杂交水平和可信度。,2.2 核酸杂交原理分子杂交(简称杂交，hybridization)是核酸研究中一项最基本的实验技术。应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA(或RNA)片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。,荧光原位杂交,2.2.1 制备样品首先需要从待检测组织样品提取DNA或RNA。用限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。将含有DNA片段的凝胶进行变性处理，转印到支持膜上并使其牢固结合。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。,2.2.2 制备探针探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。作为探针的已知DNA或RNA片段一般为3050核苷酸长，可用化学方法合成或者直接利用从特定细胞中提取的mRNA。在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。标记常用的为同位素标记法和生物素标记法。通过检测与膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的分子大小。,2.2.3 杂交杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。应用较多固相杂交：先将待测单链核酸样品（如为双链，则须先变性成为单链）结合到硝酸纤维素膜上，然后与溶液中标记探针进行杂交。首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。,2.2.4 检测检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置；用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。,第三节 核酸探针标记的方法,3.1 双链DNA探针及其标记方法3.2 单链DNA探针3.3 寡核苷酸探针3.4 RNA探针,核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针；根据是否使用放射性标记物的与否，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针；根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针；根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。,3.1 双链DNA探针及其标记方法 分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。,3.1.1 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coli DNA聚合酶就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。该酶同时具有从53的核酸外切酶活性，能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。,(2) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(3) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性，故应使用仔细纯化后的DNA。,缺口平移标记示意图影响因素: (1) 产物的比活性取决于-32PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。,3.1.2 随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。优点：(1)Klenow片段没有53外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高，可达4109 cpm/g探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。,随机引物标记示意图,3.2 单链DNA探针用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时，探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交，结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:(1) 以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针;(2) RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针。,单链DNA探针标记原理示意图,3.2.1 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中，以此为模板；以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物，在a-32P-dNTP的存在下，由Klenow片段作用合成放射标记探针；反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物；然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备，选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。,3.2.2 从RNA合成单链cDNA探针用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA，并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点，产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子，所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多，应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后，RNA单链可被迅速地降解成小片段，经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。,cDNA探针标记原理示意图,3.3 寡核苷酸探针 利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针多个简并性寡核苷酸探针组成寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与目的序列准确配对，可以准确地设计杂交条件。单一已知序列探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交。,3.4 RNA探针许多载体如pBluescript、pGEM等均带有来自噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子，它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别，合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA探针。RNA探针一般都是单链。,RNA探针具有单链DNA探针的优点，又具有许多DNA单链探针所没有的优点： RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的稳定性，所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。 RNA:RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制，所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。,噬菌体依赖DNA的RNA聚合酶所需的NTP浓度比Klenow片段所需的dNTP浓度低，因而能在较低浓度放射性底物的存在下，合成高比活性的全长探针。 用来合成RNA的模板能转录许多次，所以RNA的产量比单链DNA高。反应完毕后，用无RNA酶的DNA酶处理，即可除去模板DNA，而单链DNA探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA分离。,噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶不识别克隆DNA序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子，在异常位点起始RNA合成的比率很低。因此，当将线性质粒和相应的依赖DNA的RNA聚合酶及四种rNTP一起保温时，所有RNA的合成，都由这些噬菌体启动子起始。单链DNA探针合成中，若模板中混杂其他DNA片段，则会产生干扰。缺点：合成的探针是RNA，它对RNase特别敏感，应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase；另外如果载体没有很好地酶切则等量的超螺旋DNA会合成极长的RNA，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。,第四节 核酸分子杂交因素,4.1 核酸分子杂交促进剂4.2 核酸分子杂交反应时间4.3 不同的反应条件对分子杂交结果的影响,4.1 核酸分子杂交促进剂惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍；对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高 。,硫酸葡聚糖，广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。是一种多聚胺，平均分子量为500000。聚乙二醇（PEG），常见的一种促进剂，分子量小（60008000）、粘度低、价格低廉，不能完全取代硫酸葡聚糖。使用促进剂时有必要优化条件。在某些条件下5%10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%10% PEG则可产生很高的本底。聚丙烯酸钠盐，多聚体促进剂，浓度为2%4%。与硫酸葡聚糖相比，优点是价格低廉，粘度低（MW=90000）。,小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。,4.2 核酸分子杂交反应时间一般杂交反应要进行20h左右。1966年，Britten和Kohne推荐用C0t 值来计算杂交反应时间。C0t 值实际上是杂交液中单链起始浓度（C0）和反应时间（t）的乘积。C0t =100时，杂交反应基本完成。C0t=0，基本上没有 杂交。,例：在液相杂交中未标记的DNA 400g/ml（按单股DNA每微克紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为9.6），如果反应时间为21h，对于未标记的DNA来说，C0t =9.621 =201.6， 杂交完成。对标记DNA（浓度为0.1g/ml）来说C0t值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。,4.3 不同的反应条件对分子杂交结果的影响(1) 根据杂交液的体积确定杂交的时间：一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。(2) 根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相为水溶液时，则在68杂交，而在50%甲酰胺溶液中时，则在42下杂交。,(3) 选用不同的封闭试剂：如Denhardts试剂、肝素或一种由5%脱脂奶粉组成的BLOTTO， 这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。与Denhardts试剂相比，BLOTTO价格便宜，使用方便，可获得同样满意的结果，但不能用于RNA杂交。尼龙膜Denhardts试剂比BLOTTO能得到更高的信噪比。对硝酸纤维素滤膜而言，通常在预杂交溶液和杂交溶液中都含有封闭剂。对于尼龙膜，经常从杂交溶液中省去封闭剂，因为高浓度的蛋白质会干扰探针和目的基因的退火。,(4)根据需要在杂交过程中选用不同的振荡方法和程度，许多杂交膜一起反应时，连续的轻微振荡可获得较好的杂交结果。(5) 在杂交过程中加入其他化合物，如反应体系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG， 杂交速度可增加约10倍。检测稀有序列时常用该方法，但它们有时会导致本底较高，并由于溶液的粘稠性而使操作困难。除非在滤膜上含有的目的DNA量很少，或放射性探针的量有限，一般不用硫酸葡聚糖或PEG。,(6) 根据探针与被检测目标之间的同源程度选择清洗的程度，如具有很高的同源性可选用严紧型洗脱方式（高浓度SSC）， 反之则选用非严紧型洗脱方式（低浓度SSC）。洗脱通常在低于杂交体解链温度12-20的条件下进行。解链温度(melting temperature， Tm )是指在双链DNA或RNA分子变性形成分开的单链时光吸收度增加的中点处温度。通常富含GC碱基对的序列比富含AT碱基对序列的Tm 温度高。,(7) 根据标记探针的浓度及其比活性，选择不同的杂交条件及检测方法。一般使用新的同位素可获得较强的信号。(8) 在水溶液中杂交时，用6SSC或6SSPE溶液的效果都一样。但在甲酰胺溶液中杂交时，应该用具有更强缓冲能力的6SSPE。上述这些条件的改变，对杂交的结果有不同的影响，应根据研究的具体情况，选用适当的方法。,第五节 几种常见的杂交,5.1 Southern杂交5.2 Northern杂交5.3 菌落杂交法 colony hybridization method5.4 噬菌斑杂交法 plaque bybridization,5.1 Southern杂交步骤:(1) 酶切DNA，凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性。(2) 将DNA片段转移到固体支持物（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。(3) 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。(4) 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。,杂交流程示意图,Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后，Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32P标记的高比活性探针的(109 cpm/g)互补DNA。如果将10g基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交，曝光过夜，则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。,DNA从凝胶中转移到固体支持物上有3种方法:(1)毛细管转移本方法由Southern发明，故又称为Southern转移(或印迹)。优点：简单，不需要用其他仪器。缺点：转移时间较长，转移后杂交信号较弱。,(2) 真空转移将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流下，洗脱出凝胶中的DNA，使其沉积在滤膜上。优点：快速，在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点：如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时，其背景比毛细转移要高。,(3)电泳转移将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。优点:不需要脱嘌呤/水解作用，可直接转移较大的DNA片段。缺点：转移中电流较大，温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时，才采用电泳转移,5.2 Northern杂交Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA，其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构，保证RNA完全按分子大小分离。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上，然后与探针杂交。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。而不用NaOH，因为它会水A的2-羟基基团。,RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合，为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照像。样品胶则进行Northern转印，标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5g/ml EB的0.1mol/L 醋酸铵中10min，在水中就可脱色。,在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。从琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。,5.3 菌落杂交法 colony hybridization method对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4直至得到筛选结果。,5.4 噬菌斑杂交法 plaque bybridization噬菌体为载体进行DNA克隆繁殖时所常用的方法。把基因组中含有特定碱基序列的噬菌体，通过核酸杂交，从多数噬菌体的噬菌斑中选出的方法。将在琼脂培养基上形成的噬菌体的噬菌斑，移于硝酸纤维素滤纸上，碱处理使噬菌体DNA变性；DNA固定于硝酸纤维素滤纸上，与用放射性同位素标记的特定的RNA或DNA片段进行杂交；通过放射自显影法来识别含有所需DNA序列的噬菌体的噬菌斑，并从原来的琼脂培养基中选出与其对应的噬菌斑。,5.5 斑点杂交 （dot hybridization）斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释，还可以得到半定量的结果。简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法，在基因分析和基因诊断中经常用到，是研究基因表达的有力工具。目的序列未与非目的序列分离，不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时，难以区分目的序列信号和干扰信号。,5.5.1 DNA斑点杂交先将膜在水中浸湿，再放到15SSC中。 将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5l(210g DNA)。 将膜烘干，密封保存备用。,5.5.2 RNA斑点杂交与DNA斑点杂交类似，每个样品至多加10g总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化）方法：将RNA溶于5l DEPC水，加5l甲醛/SSC缓冲液（10SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8l点样于处理好的滤膜上，烘干。,细胞标本处理技术可以简化，不用提取和纯化RNA。方法：用含0.5%Nonidet P40的低渗缓冲液对多种动物细胞作简单处理，离心去掉细胞核和细胞碎片，就得到基本不带DNA而富含RNA的细胞质提取物，这一粗RNA在高盐下用甲醛变性，不需加工直接点到硝酸纤维素膜上。本法可以快速检测大量标本，而只需极少量的细胞（5104）或组织。整个RNA实验中，要防止激活内源性RNase，有许多种预防措施，有一种是在样品中加入核糖核苷氧矾基复合物（RVC）。,5.5.3 完整细胞斑点杂交类似检测细菌菌落，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交。不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。,第六节 其他类型杂交介绍,6.1 固相夹心杂交6.2 “电子”杂交6.3 cDNA微阵列杂交（cDNA microarray hybridization）6.4 液相杂交6.5 差异基因筛选类杂交,6.1 固相夹心杂交Dunn等最早介绍了夹心杂交类型，Ranki等又作了进一步的改进。夹心杂交法比直接滤膜杂交法有两个主要的优点：样品不需要固定，对粗制样品能做出可靠的检测；用夹心杂交法比直接滤膜杂交法特异性强，因为只有两个杂交物都杂交才能产生可检测的信号。固相夹心杂交需要两个靠近而不互相重叠的探针，一个作固相吸附探针，另一个作标记检测探针。样品基因组内核酸只有使这两个探针紧密相连才能形成夹心结构。需注意的是两个探针必须分别亚克隆进入两个分离的非同源载体内，以避免产生高的本底信号。,6.2 “电子”杂交“电子”杂交(electronic hybridization)基本原理同染色体步移是相似的，所不同的只是用EST数据库代替文库，且主要用于全长cDNA克隆。EST是长达200bp300bp的cDNA片段，世界各国的实验室将分离得到的EST输入一个公开的公共数据库中。如果有了某个cDNA的一个EST后，可输入EST数据库中去搜索同这个EST有一段共序列的另一个EST，然后把这两个EST装配成长的EST，经过多次拼接延伸，最后有可能得到一个全长cDNA序列。此时可根据这个cDNA序列设计引物，在合适的cDNA文库中作PCR，扩增出真正的全长cDNA分子。当然，在数据库中搜索和拼接EST等是借助电脑和有关的软件进行操作，所以称之为“电子”杂交。,6.3 cDNA微阵列杂交（cDNA microarray hybridization）将cDNA克隆或cDNA的PCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上（如：尼龙膜或活化的载玻片）以微点阵，然后用混合的不同DNA探针与微点阵进行杂交。利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。,6.4 液相杂交液相杂交（solution hbridization）是指使变性的待测核酸单链与放射性核素标记的已知的酸单链（探针）在溶液中保温，使之形成杂交复合物。反应结束后，用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开，然后结和后在杂交分子中的探针量，就可推算出被测的核酸量。液相核酸分子杂交类型有：吸附杂交、发光液相杂交 、 液相夹心杂交 、 复性速率液相分子杂交 等。,6.4.1 吸附杂交6.4.1.1 HAP吸附杂交羟基磷灰石层析或吸附是液相杂交中最早使用的方法，在液相中杂交后，DNA：DNA杂交双链在低盐条件可特异地吸附到HAP上；通过离心使吸附有核酸双链HAP沉淀，再用缓冲液离心漂洗几次HAP；然后将HAP置于计数器上进行放射性计数。,6.4.1.2 亲和吸附杂交生物素标记DNA探针与溶液中过量的靶RNA杂交，杂交物吸附到酰化亲和素包被的固相支持物（如小球）上；用特异性抗DNA：RNA杂交物的酶标单克隆抗体与固相支持物上的杂交物反应，加入酶显色底物。该系统可快速（2h）检测RNA。,6.4.1.3 磁珠吸附杂交Gen-Probe公司应用丫啶翁酯（Acridinium ester） 标记DNA探针、这种试剂可用更敏感的化学方法来检测；探针和靶杂交后，杂交物可特异地吸附在磁化的有孔小珠（阳离子磁化微球体）上；溶液中的磁性小珠可用磁铁吸出，经过简单的漂洗步骤，吸附探针的小珠可用化学发光测定。,6.4.2 发光液相杂交 6.4.2.1 能量的传递法用两个非常靠近的探针，一个探针的一端用化学发光基团（供体）标记，另一个探针的一端用荧光物质标记。当探针与特异的靶杂交后，这些标记物靠得很近，一种标记物发射的光被另一种标记物吸收，并重新发出不同波长的光，调节检测器使自动记录第二次发射光的波长。只有在两个探针分子靠得很近时，才能产生激发光，因此这种方法具有较好的特异性。,6.4.2.2 丫啶翁酯标记法丫啶翁酯标记探针与靶核酸杂交；未杂交的标记探针分子上的丫啶翁酯可以用专门的方法选择性除去，杂交探针的化学发光是与靶核酸的量成比例的。缺点：敏感度低（1ng的靶核酸），仅适用于检测扩增的靶序列，如rRNA或PCR扩增产物。,6.4.3 液相夹心杂交 6.4.3.1 亲和杂交 在靶核酸存在下，两个探针与靶杂交，形成夹心结构。杂交完成后，杂交物可移到新的管或凹孔中，在其中杂交物上的吸附探针可结合到固相支持物上，而杂交物上的检测探针可产生检测信号。用生物素标记吸附探针，及125I标记检测探针。这个系统的敏感性可检测出4105靶分子，该试验保持了固相夹心杂交的高度特异性。,6.4.3.2 多组合探针和化学发光检测 第一类探针是未标记的检测探针和液相吸附探针，它们有50个碱基长，其中含有30个细菌特异序列碱基和20个碱基的单链长尾；第二类探针是固相吸附探针，它可吸附在小珠或微孔板上。未标记检测探针的单链长尾用于结合扩增多体（标记探针），液相吸附探针和靶杂交物从溶液中分离并固定在小珠或微板上。,典型的试验可有25个不同的检测探针和10个不同的吸附探针；第一个标记检测探针上附着很多酶（碱性磷酸酶或过氧化物酶），可实现未标记检测探针的扩增，使用化学发光酶的底物比用显色反应酶的底物敏感。这个杂交方法用于乙肝病毒、沙眼衣原体、淋球菌以及质粒抗性的检测，敏感性能达到检测5104双链DNA分子。,6.4.4 复性速率液相分子杂交 细菌等原生物的基因组DNA通常不包含重复顺序，在液相中复性（杂交）时，同源DNA比异源DNA的复性速度要快，同源程度越多，复性速率和杂交率越快。利用这个特点，可以通过分光光度计直接测量变性DNA在一定条件下的复性速率，进而用理论推导的数学公式来计算DNA-DNA之间的杂交（结合）度。,6.5 差异基因筛选类杂交6.5.1 差异杂交（differential hybridization）差异杂交又叫差别筛选(differential screening)，是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。,适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。对基因组非常复杂的真核生物，则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5左右），价值不大。,6.5.2 扣除杂交(subtractive hybridization)扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，它是通过构建扣除文库(subtractive library)得以实现的。扣除杂交法：除去那些普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分离的敏感性。,例：T细胞受体(T-cellreceptor，TCR)编码基因的分离T细胞和B细胞来自共同的前体细胞，两者都能够识别特异的抗原。但与B细胞不同，T细胞不能识别游离的抗原，而只能识别展现在其它细胞表面的抗原。T细胞的这种抗原识别特异性是由TCR基因决定的。TCR基因只能在T细胞中表达，而不能在B细胞中表达。,从T细胞mRNA制备来的单链cDNA，同大大超量的B细胞的mRNA在有利于发生DNA-RNA杂交的条件下保温。其结果便会出现这样的情况：所有的能够在T和B两类细胞中同时表达的T细胞基因的cDNA分子(约占98)，都能与B细胞的mRNA退火形成DNA-RNA杂交分子;不能在B细胞中表达的、T细胞特有的cDNA(约占2)，不能形成DNA-RNA杂交分子，仍然处于单链的状态。,将杂交混合物通过羟基磷灰石柱(hydroxylapatitecolumn)，于是DNA-RNA杂交分子便结合在柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。回收T细胞特异的cDNA，转变为双链DNA之后，与适当的噬菌体载体重组井转染给大肠杆菌寄主细胞，这样便得到了T细胞特异eDNA高度富集的扣除文库。再按照同样方法制备扣除的cDNA探针，即被B细胞mRNA杂交扣除后所得的T细胞特异的cDNA探针，筛选文库，可以分离到了T细的TCR基因。,6.5.3 抑制性扣除杂交（SSH）该方法运用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA，从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致。所谓抑制PCR，则是利用链内退火优先于链间退火，从而使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。,SSH自从在克隆基因的实验中采用以来，其优势是非常明显：（1）极大降低了假阳性率，SSH方法采用两次扣除杂交和两次PCR，保证了该方法具有较高特异性。据有关报道证明SSH方法假阳性率可降至6%;（2）高度灵敏性，由于在反应中将丰度不同的单链分子含量归一化，保证了低丰度mRNA检测成功;（3） SSH法在一次反应中，可同时分离出上百个差异表达的基因，这一点远胜于DDRT-PCR和RAD。,第七节 原位杂交,7.1 原位核酸分子杂交技术的发展7.2 原位分子杂交技术的基本方法7.3 RNA原位核酸杂交7.4 双重原位杂交方法7.5 原位杂交的PCR增敏法7.6 原位杂交的CSA增敏法,原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体；然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。,原位杂交已用于基础研究如基因组图，转基因检测，基因表达定位，核DNA和RNA的mRNA的排列和运输，复制和细胞的分类。临床研究应用在细胞遗传学，产前诊断，肿瘤和传染性疾病的诊断，生物学剂量测定和病毒学的病原学诊断等。,7.1 原位核酸分子杂交技术的发展1969年，美国耶鲁大学Gall和Pardue创立原位杂交，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，BuongiornoNardelli和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。1970年，Orth应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。,1981年，Bauman等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。1982年，Shroyer报道用2，4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂交信号。1983年，Brigat首先建立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位，生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。,1987年，地高辛标记的有关试剂及药盒被投放市场，和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶显色系统)，有较好的反差背景，更有利于与免疫组织化学相结合，同时可以检测基因表达。,7.2 原位分子杂交技术的基本方法原位杂交技术的基本方法包括：杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；杂交；杂交后处理；显示(visualization)：包括放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色。,7.2.1 固定固定的目的是为了保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA更易被酶降解，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，取材后应尽快予以冷冻或固定。,(1)最常用多聚甲醛固定组织，因其不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，不会影响探针穿透入细胞或组织。(2)醋酸-酒精的混合液和Bouins固定剂也能获得较满意的效果。(3)mRNA定位，将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中12 h，冷冻前浸入15%蔗糖溶液置4冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。,(4)组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10 min，空气干燥后保存在-70。如冰箱温度恒定，在-70切片可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材时多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号；石蜡包埋切片由于与蛋白质交联的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。,各种固定剂均有各自的优缺点：沉淀性(Precipitating)固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouins液、Carnoys液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存RNA，而且对组织结构有损伤。戊二醛较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交联，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。,7.2.2 玻片和组织切片的处理7.2.2.1 玻片的处理玻片包括盖片和载玻片应用热肥皂水刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24 h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24 h后蒸馏水冲洗、烘干、烘箱温度最好在150或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。,用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附剂有铬矾明胶液，其优点是价廉易得，粘附效果较差。多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵。新粘附剂APES粘附效果好，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可长期保存应用。,7.2.2.2 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂(detergent)或称清洗剂Triton X100、酒精或某些消化酶如蛋白酶K，胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。这种广泛的去蛋白作用无凝可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应填为掌握。,7.2.2.3 减低背景染色背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后的酶处理和杂交后的洗涤均有助