基因组学遗传图绘制

第2章 遗传图绘制,基因组计划包括三个阶段工作： 遗传图的构建 物理图的构建 DNA全序列测定 ？每次测序反应可阅读的DNA长度1000bp,Genetic map,(Also known as a linkage map) a chromosome map of a species that shows the position of its known genes and/or markers relative to each other, rather than as specific physical points on each chromosome -Dr. Eric Green, of the National Human Genome Research Institutes Genome Technology Branch, defines genetic map,基因组作图的基本构想,在长链DNA分子的不同位置寻找特征性的分子标记，根据分子标记将包括这些序列的克隆进行连锁定位，绘制基因组图 重叠群法 所谓重叠群（contig）系指相互间存在重叠顺序的一组克隆 直接鸟枪法,基因组测序的不同策略,鸟枪法的顺序组装,鸟枪法的问题,2.1 遗传图与物理图,遗传作图（Genetic mapping）采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分析。遗传图距单位:厘摩(centi-Morgan, cM), 每单位厘摩定义为1%交换率 物理作图（Physical mapping）采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异辐射杂种（radiation hybrid）作图的计算单位为厘镭(cR)限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度，即碱基对,经典遗传图谱,绘制遗传图谱就是要进行每条染 色体上基因座位的顺序和距离的确定，即主要通过家系分析，对不同性状之间、性状与标 记之间、标记与标记之间的连锁遗传频率进行计算，最终绘制遗传连锁图方法：家系分析法体细胞杂交定位法等染色体易位作图、染色体缺失作图：体细胞杂交定位中较为精细的方法,家系分析法,家系分析法(pedigree method)对某家庭性状相关成员进行 统计，分析性状之间的连锁关系，通过重组率进行相关基因定位，这种方法称为家系分析法，又称系谱分析法 1968年约翰霍普金斯大学的学生Donahue在做染色体实验时发现自己的1号染色体缢痕区增长，通过对他自己家族染色体的观察，进一步发现这一异常是遗传的，并与特殊血型（Fy）具有平行性，因此将血型基因定位于1号染色体上，这是首次定位常染色体上的基因，从而建立了细胞学定位法1973年发现第二条染色体短臂缺失（2P）的患者红细胞酸性磷酸酶（ACP1）活性明显降低，于是将此酶定位于第2条染色体上，这就是利用剂量效应的方法,伴性遗传法(XY-linkage inheritance),伴性遗传法主要是根据人类性染色体组成和伴性遗传原理进行XY染色体上基因的定位Y染色体“全男性遗传”蹼趾男人：美国的斯柯菲尔德家庭的14个男人在其第23趾间都长有一个蹼状的联系物（如同鸭子脚上的蹼），而患者的11个女儿没有一个有此性状，这些女子结婚后子女也没有带此性状的，因而认为蹼趾是Y伴性遗传。但是蹼趾这个症状也有男女都有的，只是男患者多于女患者。因此，有人认为蹼趾的遗传性尚不能完全肯定为Y伴性遗传长毛耳男人 ：患者的耳廓上长有长而硬的毛。这种病在印第安人中发现的较多，高加利索人，澳大利亚土人、日本人、尼日利亚人中也有少数发现,体细胞杂交定位法,体细胞杂交定位法(somatic cell hybridization)应用不同物种的细胞培养获 得 杂种细胞系(hybrid cell line)，根据不同杂种细胞中保留的极少数人的染色体与某些相关基因的对应关系进行基因定位的方法,染色体定位,染色体定位的方法：同线分析法克隆分布板法建立含有单条人染色体的体细胞杂交,同线分析法,将连锁分析原理用于杂种细胞染色体分析的方法称为同线分析连锁分析主要是依据两观侧基因的分离及性状重组情况，通过重组值来判断基因在染色体上的分布当重组值为50%时，可能性有三种：位于不同染色体上位于同一染色体臂，但距离较远位于着丝点两侧 同线分析是根据两个基因与整条染色体的同步性来判断两基因是否同在一条染色体上。如果两基因位于一条染色体，则两基因随染色体共同分离；若不在同一染色体，要发生程度不同的自由组合,染色体区域定位染色体易位,体细胞杂交法只能把基因定位在某一条染色体上，但较为精细的区域不能确定若把体细胞杂交法与染色体易位结合起来，可确定某一基因在染色体上的具体位置，即区域定位,染色体区域定位染色体缺失,通过诱变剂处理人的细胞，将含有断裂染色体的细胞与小鼠细胞融合，筛选含有缺失人的染色体片段的杂种细胞先使人鼠细胞杂交，获得含有人的一条染色体的杂种细胞系，再使其断裂，分离不同断裂类型的亚克隆前者可获得不同染色体的许多缺失杂种。后者只获一种特定染色体的某些缺失杂种。对区域定位来讲，后者更为便利。通过染色体结构变异已经定位了一些人类疾病基因,二、现代遗传图谱,原位杂交标记构建第一代标记是限制性片段长度多态性RFLP第二代标记位点是大量的可变数量串联重复（VNTR)，包括微、小卫星(MS)或短串联重复(STR 或SSLP)第三代标记是位点极其丰富的单核苷酸多态性(SNP),原位杂交,原位杂交(in situ hybrization)是Hogness G于1975年首次提出的多态性标记的检测方法基础：分离和克隆获得的基因或随机片段，将这些克隆片段用同位素、生物素或荧光染料进行标记后，作为探针，直接在玻片上与细胞分裂中期染色体DNA进行杂交，经过放射性自显影或荧光信号显示，确定这一基因在染色体上的杂交位置统计、分析、汇总各中期细胞内的染色体结果，选出杂交最集中的染色体区域，便是该基因在染色体上的具体位置,染色体原位杂交,染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的分子标记技术目前发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, 简称FISH技术），是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置,荧光标记原位杂交原理示意图,原位杂交技术的基本步骤,制备探针染色体制片染色体处理与变性染色体与探针杂交显微检测,染色体专一位点探针,荧光标记探针检测精子,2.2 遗传作图标记,基因标记缺点：高等生物基因组很大，而基因的数目是十分有限的，许多性状都涉及多基因 ，基因组中存在大量的基因间隔区，纯粹用基因作为标记将在遗传图中留下大片的无标记区段DNA标记,DNA标记,RFLP (Restriction fragment length polymorphisms, 限制性片段长度多态性) 简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphisrns, SSLPs） 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）,（1）限制性片段长度多态性(RFLP),RFLP是指不同个体基因组内的核苷酸序列因某种原因产生碱基突变后，改变了某种限制性内切酶的剪切位点，形成了长度不等的限制性片段限制性片段在人类不同个体间呈现的多态性现象称为限制片段长度多态性,RFLP的特征,RFLP是第一种被用于作图研究的DNA标记，它们一般有如下特征处于染色体上的位置相对固定同一亲本及其子代相同位点上的多态性片段特征不变同一凝胶电泳可显示不同多态性片段，具有共显性特点,Mechanism of DNA cleavage by the restriction enzyme BamHI,In a RFLP, alleles may differ in the presence or absence of a cleavage site in the DNA,Southern blot,PCR（Polymerase chain reaction）,The first 4 cycles of PCR in detail,（2）简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphisms, SSLPs）,有二种类型的SSLP常用于作图：,小卫星序列（minisatellite），有时又称可变串连重复（variable number of tandem repeats, VNTR），其重复单位的长度为数十个核苷酸 微卫星序列（microsatellite）或简单串联重复（simple tandem repeats, STR or SSR），其重复单位为1-6个核苷酸，由10-50个重复单位串联组成,可变数量串联重复(VNTR),小卫星DNA的核心序列一般为几个到几十个核苷酸，不同个体的不同基因座位重复次数不同，每个重复单位的组成可略有变异位置：一般在染色体端粒部位，广泛存在于人体基因组中,简单序列重复标记，SSR,微卫星DNA(Micro-satellite DNA)标记属高度重复序列，重复单元26bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重复，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中呈现孟德尔式遗传目前微卫星DNA已经发现了万余个位点,TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG,微卫星DNA PCR扩增结果（示例）：,500bp400bp300bp240bp,该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种,（三）单核苷酸多态性标记(SNP),单核苷酸多态性(SNP)是第三代标记，被用于遗传图谱构建及功能分析由于SNP在不同个体间和不同组织、细胞间高度多态性，使其成为研究基因多样性和识别、定位疾病相关基因的一种新型手段,检测SNP的特异杂交,DNA芯片（DNA chip）技术,DNA芯片,动态等位专一性杂交（Dynamic allele-specific hybridization, DASH）,反应在溶液中进行，样品置于96孔板的每个凹槽中，由于荧光标记试剂只与双链DNA结合，所以只有可杂交的分子发出荧光实验初始时保持可使单个碱基错配的反应条件，此时寡聚核苷酸可与任何等位SNP分子杂交随后逐步提高反应温度，由于完全互补配对的杂交分子较之含有错配硷基的杂交分子可耐受较高的温度当反应温度升高到临界点时，含有错配的杂交分子将会解链，荧光信号同时消失，说明该样品中含有SNP,SNP的研究前景,对于人类来说，SNP的意义在于：致病SNP疾病易感性SNP具有诊断价值的SNP疾病的SNP谱人表型相关SNP药物作用与不良反应的SNP药物剂量SNP,日本学者发现糖尿病基因的个人SNP差别,日本研究人员最近经过研究发现，与糖尿病有关的基因并不是千篇一律，它们之间存在着个人差别，即“单核苷酸多态性”（SNP）,其它的DNA标记（分子标记）,AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism 即扩增片段的长度多态性） STS（序位标签）是由一段长度为200500bp的序列所界定的位点，在基因组中只出现一次 相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）靶位区域扩增多态性 (target region amplified polymorphism，TRAP)由美国农部北方作物科学实验室Hu与Vick于2003年提出。与SRAP、RAPD和AFLP等标记技术无须任何序列信息即可直接PCR扩增不同，TRAP技术是基于已知的cDNA 或EST序列信息,DNA分子标记系统相互关系,DNA分子标记的多态性分子基础, 表示酶切位点 表示PCR引物- - - 表示插入或缺失片段 表示串联重复序列. 表示省略的序列,2.3 遗传作图的方法,2.3.1 孟德尔遗传学简介 2.3.2 连锁分析,2.3.1 孟德尔遗传学简介,2.3.2 连锁分析,遗传图的偏离,重组率高：近端粒区和远着丝粒区重组热点（RHS）老鼠主要组织兼容性复合座位（major histocompatibility complex, MHC），免疫人类1号染色体,人类染色体遗传图与物理图长度比较,不同模式生物的连锁分析,有性杂交实验 系谱分析 DNA转移,2个测交的例子,人类系谱分析的例子,细菌的遗传作图,细菌的基因作图,1987年发表了第一份人类RFLP连锁图，含393个RFLP和十个其它多态性标记（Donis-Keller, 1987）。这张基因组连锁图来自21个家庭，平均密度为10 Mb 19