第十章 发酵染菌及其控制课件

,染菌及其防治,1,PPT学习交流,知识目标掌握染菌对发酵过程的影响；掌握发酵异常现象及原因分析掌握杂菌污染的途径能力目标：能够发现种子培养和发酵的异常现象；能进行染菌的检查和判断、发酵染菌原因分析；能杂菌污染的挽救与处理措施。,2,PPT学习交流,第一节染菌对发酵的影响第二节发酵染菌的分析第三节杂菌污染的途径和防止染菌,3,PPT学习交流,第一节染菌对发酵的影响,纯种培养要求必须防止杂菌污染，为防止染菌，采取措施：密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作,4,PPT学习交流,染菌率的统计,以发酵罐染菌批（次）为基准，染菌罐批（次）应包括染菌重消的重复染菌批（次）在内。整个发酵周期中，无论前期或后期染菌，均作“染菌”论处。,5,PPT学习交流,一染菌对不同发酵过程的影响,青霉素发酵：发酵前、中、后期都很容易感染能产青霉素酶的杂菌，能使青霉素迅速破坏，使发酵一无所获。,6,PPT学习交流,柠檬酸发酵：产酸后，发酵液pH很低，不易染菌，主要防止前期染菌。但对于能在较低pH发酵液中生长的杂菌来讲，其对柠檬素发酵危害也很大，如青霉菌。,7,PPT学习交流,谷氨酸发酵：周期短，产酸快，培养基不太丰富，不易染菌，主要防噬菌体。一旦受到噬菌体污染，其蔓延迅速，难以防治，而且容易造成连续污染。,8,PPT学习交流,疫苗发酵：现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。,9,PPT学习交流,肌苷、肌苷酸发酵：生产菌为多种营养缺陷型，生产能力差，培养基营养丰富，易受到各种生长较快的杂菌污染，如芽孢杆菌，而且染菌后培养基中营养成分迅速消耗，严重抑制生长菌生长和产物的生成。,10,PPT学习交流,二不同时间发生染菌对发酵的影响,种子培养期染菌：培养基营养丰富，容易染菌，而且种子染菌对发酵危害较大，应严格控制种子污染。,11,PPT学习交流,发酵前期染菌：较容易染菌，污染后杂菌迅速繁殖，与生产菌争夺营养成分和氧，严重抑制生产菌的生长繁殖，最终导致产物的积累大大减少，甚至造成发酵失败。,12,PPT学习交流,发酵中期染菌：危害极大，不但影响生产菌的继续生长，还会严重干扰生产菌的产物合成代谢，减少产物的生成。而且由于营养成分大量消耗，发酵产物正在大量积累，一般挽救处理困难，危害性很大。故在实际生产中应做到早发现快处理。,13,PPT学习交流,发酵后期染菌：发酵后期产物积累较多，营养接近耗尽，此时染菌影响相对小些，一般可继续发酵；若污染严重，可采取提前放罐来减少损失。,14,PPT学习交流,三染菌程度对发酵的影响,染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌数目越多，对发酵的危害越大染少量杂菌，有时可以容忍。,15,PPT学习交流,四染菌对产物提取和产品质量的影响菌体自溶，发酵液发粘、发臭，过滤困难,16,PPT学习交流,第二节发酵染菌的分析,一发酵染菌的异常现象指由于发酵染菌导致发酵过程中某些物理参数、化学参数或生物参数发生于原有规律不同的改变。1种子培养染菌后的异常现象2发酵染菌后的异常现象,17,PPT学习交流,1种子培养染菌后的异常现象,菌体浓度异常：包括菌体浓度逐渐降低和菌体浓度迅速升高理化指标异常：杂菌生长则导致宏观理化指标发生变化，如温度、pH值等代谢异常：碳源、氮源消耗速度发生变化。,18,PPT学习交流,2发酵染菌后的异常现象,菌体浓度异常：发酵中菌体或菌丝浓度是固有规律在变化pH值过高或过低：pH值变化是所有代谢的综合反映，固定发酵阶段pH值具有一定规律,19,PPT学习交流,溶解氧和二氧化碳水平异常：可以断定是发生染菌现象,20,PPT学习交流,泡沫过多：污染噬菌体非常容易产生过多泡沫,21,PPT学习交流,代谢异常：营养物质的利用和产物的生成出现异常现象。,22,PPT学习交流,二染菌的检查与判断1.染菌的检查,显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）平板划线培养或斜面培养检查法；平板制好后，应先保温24小时，确定无菌,23,PPT学习交流,肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4）双层平板培养法检查,24,PPT学习交流,25,PPT学习交流,2.检查法的不足,以上3种检查法未发现染菌，还不能肯定未被染菌原因是以上检查法只能检查杂菌浓度较大的染菌情况（1个/ml）,26,PPT学习交流,三染菌原因的分析,造成发酵染菌的原因有很多，归纳起来有：种子带菌、无菌空气带菌、设备渗漏、原辅料灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善。,27,PPT学习交流,项目百分率%总空气系统有菌19.96种子带菌或怀疑种子带菌9.64夹套穿孔12.36盘管穿孔5.89接种管穿孔0.39阀门渗漏1.45搅拌轴密封渗漏2.09罐盖漏1.54其它设备渗漏10.13操作原因10.15接种时罐压跌零0.19培养基灭菌不透0.79泡沫冒顶0.48原因不明24.94,几家抗生素工厂发酵染菌原因,28,PPT学习交流,上海第三制药厂染菌原因分析,29,PPT学习交流,管理不善而染菌的有31个罐批，占25.08。经分析有下列原因：项目百分率%进罐前未做设备严密度检查25.8接种违反操作规程25.8检修质量缺乏验收制度19.35操作不熟练19.35配料违反工艺规程6.45调度不当3.25,30,PPT学习交流,上海第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析项目百分率%空气系统有菌26.00接种11.00管理问题7.80外界带入杂菌（取样、补料）8.20设备穿孔7.60停电罐压跌零1.60蒸汽压力不足或蒸汽量不足0.60操作违反规程1.60种子带菌0.60原因不明35.00,31,PPT学习交流,一般染菌原因分析,不同染菌时间分析不同染菌类型分析不同染菌幅度分析,32,PPT学习交流,（1）染菌的时间分析种子培养阶段：种子，灭菌，操作；发酵前期：种子，灭菌，操作；发酵后期：空气，补料，设备渗漏，泡沫,33,PPT学习交流,（2）染菌的杂菌种类分析：杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角）杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，设备渗漏，管理操作等）杂菌是真菌,34,PPT学习交流,（3）染菌的规模分析大批量发酵罐染菌：种子、空气；前期：种子带菌，灭菌问题；中后期：空气带菌；部分发酵罐染菌：个别发酵罐连续染菌：设备渗漏,35,PPT学习交流,第三节杂菌污染的途径和防止染菌,种子带菌及防治空气带菌及防治培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防治操作失误和设备渗漏导致的染菌及防治噬菌体污染及防治染菌的挽救与处理,36,PPT学习交流,1、种子带菌的防治,菌种在培养或保存过程中受污染（试管塞，查看的时候要注意）培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压菌种在转接过程中受污染：操作不当，管理不严；（缓冲间）,37,PPT学习交流,2、无菌空气带菌及其防止：流程设计，介质灭菌,38,PPT学习交流,3、培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防治,原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；可升温前搅拌和加淀粉酶实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升温时，应打开排气等阀门放气。,39,PPT学习交流,连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底设备和管道存在“死角”死角：由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不能达到彻底灭菌的要求。,40,PPT学习交流,常见的设备、管道“死角”发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐罐底脓疱状积垢。,41,PPT学习交流,42,PPT学习交流,43,PPT学习交流,4、设备渗漏引起的染菌及其防止,发酵设备、管道、阀门长期使用，由于腐蚀、摩擦和振动等原因，造成渗漏微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞指示剂的白布擦，有渗漏则白布显红色。,44,PPT学习交流,5、操作失误导致染菌及其防治,灭菌过程中严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫大量产生传感器探头用化学试剂浸泡法灭菌可能导致灭菌不彻底。,45,PPT学习交流,灭菌过程中严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫大量产生传感器探头用化学试剂浸泡法灭菌可能导致灭菌不彻底。,46,PPT学习交流,6、噬菌体污染和防治,47,PPT学习交流,（1）噬菌体污染的预防严格活菌体排放，切断噬菌体的粮源做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内抑制罐内噬菌体的生长,48,PPT学习交流,（2）污染噬菌体后的处理方法并罐法转换使用菌种或使用抗性菌株放罐重消法低温重消重接种法添加噬菌体抑制剂的方法,49,PPT学习交流,五、染菌的挽救与处理,种子培养期染菌的处理灭菌、重新制种、倒种发酵前期染菌的处理,50,PPT学习交流,发酵中后期染菌的处理废液应加热至120，保持30min才能放罐染菌后对设备的处理重新使用前，应彻底清洗，空罐灭菌,51,PPT学习交流,种子培养期染菌的处理,种子罐染菌,备用种子,有,52,PPT学习交流,发酵前期染菌