生物气溶胶科学、技术、工程的过去、现在以及将来

生物气溶胶科学、技术、工程的过去、现在及将来北京交通大学土木建筑工程学院 北京 100044摘要：差的空气卫生造成的生物气溶胶污染已经给人们带来了各种不利的健康影响以及疾病的发生。此外，生物恐怖袭击等也逐渐威胁人类的安全。目前，大体积生物采样，实时生物监测技术、生物气溶胶定量及控制以及疾病爆发于生物气溶胶暴露是当前生物气溶胶的研究方向。虽然自从19世纪晚期，生物气溶胶领域已经取得了突破性的进展，但是与其他学科相比，仍然有很多不足需要研究。该论文旨在综述当前生物气溶胶领域的科学技术。关键词：生物气溶胶；样品采集；PCR；宏基因组Bioaerosol Science, Technology, and Engineering: Past, Present, and FutureREN JiaDepartment of Civil Engineering , Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, ChinaAbstract: Poor air hygiene as a result of bioaerosol contamination has caused diverse forms of adverse health effects and diseases. In addition, global biosecurity is threatened by purposeful use of biowarfare agents and the vulnerability of people to the infectious agents. Accordingly, developments in high-volume biosampling, including aerosol-to-hydrosol techniques with low cut-off size, real-time bioaerosol detection, adequate biological quantification, and exposure control, as well as the investigation of the link between disease outcome and bioaerosol exposure, are current areas of bioaerosol research. Although milestone progress has been achieved both in bioaerosol sampling and analysis techniques since late 1800s, compared to atmospheric chemistry the bioaerosol field is still understudied. This work is conducted to broadly review current state-of-the-art sciences and technologies in the bioaerosol field.Key words: bioaerosol; sampling; PCR; metagenomic大量的研究证明生物气溶胶可以通过呼吸作用对人体健康产生负面的影响，涉及到病原微生物的时候，甚至会造成死亡（Douwes et al.2003）。生物气溶胶通常是指悬浮在空气中的空气动力学直径小于100m的含有生物成分的颗粒，包括细菌、病毒、真菌、花粉、植物碎片以及它们的分泌物，比如内毒素、葡聚糖、过敏原和霉菌毒素（Cox 1995）。人类打喷嚏时也会产生大量的生物气溶胶，有研究表明，室内的生物气溶胶可能包含有呼吸致病菌、尘螨、真菌孢子、菌丝体和其他生物质，更容易引起过敏性或传染性疾病。除此之外，一些人为活动，比如废物回收、生物堆肥土地利用、农业、制药业以及一些生物分析技术也可以产生各种形式的生物气溶胶。虽然一些研究表明儿童在一定程度的内毒素暴露条件下可能会对其抵抗湿疹和哮喘产生积极的影响（Tischer et al. 2011），但更多的研究表明生物气溶胶污染可能会引起呼吸道感染，过敏性反应等。在美国，生物气溶胶会造成大约年均2.5亿次呼吸道感染事件，7千5百万就诊人次，1.5亿天病假，100亿医疗费用，外加大约100亿的经济损失（Cox 1995）。2003年严重急性呼吸道综合症（SARS）的爆发以及2009年全球性的HIN1病毒感染事件极大的引起了世界范围内的关注。此外，由于地区动荡和政治冲突，生物恐怖主义的威胁日益严重，对人类健康构成严重的威胁。生物气溶胶除了会对人体健康产生影响外，也可能会通过全球性的扩散影响公众和生态环境。总之，人类正面临着日益严重的生物气溶胶感染威胁。1 生物气溶胶的发展经历了19世纪的黄金时代，生物气溶胶已经迎来了新的快速发展的新纪元。达尔文最早在1833年从空气灰尘中发现了霉菌孢子，Pasteur在1861年提出空气中存在有人类肉眼不可见的微生物，驳斥了之前的无生源说。Haldane和Anderson在1887年发表了一篇突破性的研究，他们调查了英国某学校以及居民房间内的空气中的霉菌和细菌，说明了通风和昼夜差异对空气中霉菌和细菌的影响，此后科学家们陆续在空气中发现了青霉菌孢子、苏云金芽孢杆菌以及在医院空气中发现天花病毒的传播。1908年，一种新的采样方法类似于液体捕捉法的方法发表在科学杂志上，使得分离空气中细菌成为可能。此后，人们对气溶胶做了大量的研究。2 生物气溶胶的发生及采集2.1 生物气溶胶的发生当评价一种新的生物气溶胶采样器或者控制技术的效果时，微生物通常需要首先被雾化，实验室一般使用一个喷雾器将相应微生物的悬浊液雾化，然而这种方法在微生物反复被雾化的过程中可能会对其可培养性产生不利影响。因此，人们逐渐发明了一种新的相对温和的雾化器液体喷射雾化装置（Liquid sparging aerosolizer, LSA），该装置使用蠕动泵输送微生物悬浊液，微生物只经过一次雾化过程，从而维持有限程度上的损伤。已有研究表明，该装置可以提供稳定的气溶胶/微生物气溶胶浓度（Mainelis et al.2005），但由于在使用过程中需要增加一台机械设施，这也在一定程度上阻碍了它在实验室的广泛推广应用。对于如何获得真菌孢子气溶胶，通常采用干式法，即从被真菌污染的污染物表面通过风吹获得。在某个实验室小试时发现从琼脂培养基表面通过干式获得了与基于液体发生装置不同的非凝聚真菌孢子，同时真菌的种类、通过污染物表面的风速、污染物表面结构以及材质均会影响真菌孢子的释放（Gorny et al.2001），同时使用干式法也可以比避免更多的培养介质的干扰，同时具有良好的可再现性，且操作简单，成本低（Kanaani et al.2008）。近些年来，电离子发射技术也被越来越多的应用于生物气溶胶的发生方面。电粒子发射是一种利用喷嘴和接地平板间的高电压来产生高度带电荷的细小气溶胶颗粒的方法，与传统的碰撞雾化法相比，电粒子发射技术由于产生的粒子具有相同的电荷极性可以显著减少细菌团块现象的发生（Jung et al.2010）。也有研究表明，电粒子发射技术和一个带电的喷雾器连用可以得到更稳定的噬菌体气溶胶颗粒（Eninger et al.2009）。然而，电粒子发射气溶胶颗粒会携带有大量的基本电荷，甚至达106个基本电荷，如此高的电荷可能会对气溶胶采集产生不利的影响，同时有研究表明，带有100个基本电荷的1m的颗粒在人体肺中的沉积速度比同样大小电中性的颗粒的沉积速度快10倍（Bailey 1997），如果没有充分的保护措施，这些高的带电颗粒加剧了实验室人员的吸入风险，这在一定程度上阻碍了电粒子发射技术产生气溶胶在实验室范围内的应用。虽然如此，由于电粒子发射技术可以产生单分散粒径的气溶胶，该方法也越来越多的应用于气溶胶发生。2.2 生物气溶胶的采集常见的生物气溶胶采样方法有撞击法、液体捕捉法和膜过滤法，为了使用现在可行的分子学技术或者生物化学手段对生物气溶胶样品进行全面充分的分析，采样过程中重要的评价指标之一就是气溶胶转移到水溶胶的效率。已经证明液体捕捉法可以实现这一目标，但是粒径较大的真菌可能会在入口损失，而且采样速率低。BioSampler是一款典型的普遍使用的模拟人体鼻子的液体捕捉采样器，采样速率为12.5L/min，它通过最小化颗粒撞击距离和减少颗粒重复气溶胶化优化了AGI-30采样器，BioSampler采集的样品可以用微生物分析技术如酶联免疫吸附测定或定量PCR方法来进行生物暴露评估分析。为了进一步提高对微生物气溶胶污染的反应速度，还需要进一步开发气溶胶到水溶胶的大体积采样器。相比于其他考虑因素，高流量和携带方便成为生物气溶胶采样的两个关键考虑因素，通常采样体积越大意味着能量消耗越大，设备安装越不方便；另一方面携带方便则对电池效率要求较高。也已出现一些大体积气溶胶到水溶胶的采样器，BioGuardian空气采样器采样速率在1001000L/min，对应将气溶胶收集到1015mL液体中；SpinCon的采样速率为450L/min，对应液体体积为10mL；BioCapture采样速率为200L/min，对应液体体积为5mL。最近，劳伦斯利物莫国家实验室发明了一种体积紧凑的气溶胶采样器，在采样速率为225L/min的条件下可以将大体积空气中的气溶胶转移到1mL液体中，就低的采样速率和最终收集的液体体积而言，该采样器实现了高的气溶胶转移比率。除了液体捕捉采样法外，还有单级或多级的碰撞采样器，常见的撞击采样器有BioStage及Andersen六级采样器。这种撞击法采样器可以通过一个微流体通道和先进的生物气溶胶自动检测技术连用。近年来，静电采样法由于其自身的带电性越来越受到人们的关注，一项研究表明在某种条件下静电场采样器比BioStage撞击采样器获得的可培养细菌或真菌浓度高58倍（Yao and Mainelis 2006），而且静电法可以直接将气溶胶转移到水溶胶当中；此外，也有研究表明，在低采样速率和高的静电场条件下，静电采样法对空气中的过敏原和毒素的采集效果比BioStage更突出。与液体捕捉采样法相比，静电采样法需要消耗更低的能耗，采样效果受静电场强、采样速率及目标微生物所带电荷影响，在一定的条件下对0.30.5m的颗粒的采样效率可以达到90%。考虑到静电采样法的诸多优势，应该将该采样方法与现代分子学技术连用，从而实现更好的生物暴露评估和气溶胶污染监测。然而静电采样法面临的最大的挑战是采样速率高的条件下采样效率低，提高采样速率可以一定程度上改善采样效率，但如果电压太高，可能会击穿空气。3 基于PCR技术的微生物分析技术虽然传统的生物培养法也可以用来定量生物量，但该方法存在很大程度的偏差，可能无法检出一些重要的微生物种类或者不可培养的微生物。这在很大程度上归功于两个原因，一是基于培养基撞击法的采样技术通常降低了样品采集效率或者降低了更细小颗粒的采集效果，二是只有很少的微生物，大约不到1%的微生物可以生物培养。分子生物学技术，如PCR，qPCR，RT-PCR等可以检测不可培养的细胞，这样一来就加深了人们对生物气溶胶微生物种群的理解以及风险评估。近年来，基于PCR的分子生物学技术已经逐渐的被应用于分析空气样品中的微生物（Evgrafov et al. 2010）。PCR可以使从环境样品中提取的一小段目标DNA或RNA片段在聚合酶的作用下成千上万倍的扩增，而样品中DNA的初始浓度可以由定量时的标线及Ct值决定。PCR技术的使用不仅极大的降低了环境样品的检测限，同时也缩减了进行有效分析时样品的采集时间，已有研究证明，qPCR的检出限在50100copies/mL（Ide et al.2003）不等。最近的研究表明，空气样品中细菌浓度差异至少在1.33.2倍（Hospodsky et al. 2010）时，qPCR才可以检测出其中的区别。在另外一项最近的研究中，高密度DNA微阵列系统发育分析成功的被应用到描述城市气溶胶的多样性（Brodie et al. 2007）。除此之外，PCR技术还被广泛的用来定量空气样品中的真菌孢子等（Haugland et al. 2002）。当然，这些分子生物学技术也存在一些劣势，比如DNA提取和PCR过程产生偏差，腐殖质抑制等环境因素的干扰，较长的检测时间以及大量的操作实验。此外，微生物碎片和动物过敏原等不可以用PCR技术进行分析，PCR技术并不能判断微生物的存活情况等，然而，存活情况对于病原菌感染非常重要。除了上述一些限制因素外，在PCR之前的样品准备可能带来的DNA样品污染等也是PCR技术的另一个问题。虽然如此，基于PCR技术在气溶胶领域的应用与传统生物培养法相比已经极大的降低了样品的检出限，是生物气溶胶研究领域一个里程碑式的进步。综述，PCR技术仍将是环境科学和工程领域最具潜力的生物分析技术。在另一方面，生物气溶胶里不可培养的生物有机质，比如内毒素、葡聚糖等，同样也不可以用生物培养法进行鉴定分析，这就极大的低估了生物气溶胶的暴露评价，从而影响控制策略的制定，使用生物化学方法，比如ELISA和LAL，可以帮助人们对不可培养的生物质进行分析定量。4 基于宏基因组技术的微生物气溶胶分析北京大学Chen教授克服了气溶胶大体积采样及膜DNA提取效率低的难题，利用宏基因组技术对北京严重雾霾期间（2013年1月8日到14日）空气中PM2.5和PM10颗粒物的微生物，尤其是过敏原和致病菌进行了分析研究。Chen采用大体积膜过滤采样方式，分别采集PM2.5和PM10颗粒物，膜大小为采样速率为1.13m3/min连续采样23h，总体积为1559m3。滤膜在使用前在马弗炉中500烘烤5h，用高压灭菌的铝箔纸包好，在采集过程中，所有接触膜的仪器（镊子，剪刀等）均需每天高压灭菌。PM10和PM2.5颗粒分别用1/4和（1+3/4）张膜剪成小片，在装有小球的小管中200g离心2h后，悬浊液用0.2m的膜过滤，然后将膜剪碎用Mo-Bio Powersoil DNA提取试剂盒提取DNA，为了提高提取效率改进了柱纯化方法，提取后的DNA保存在-80。通过宏基因序列及系统发育分析以及对样品中微生物栖息地溯源，数据库中所得的所有16s序列可以分为4种栖息环境（陆地、排泄物、淡水、海水），得到以下结论：（1）通过与Gg 16S数据库比较发现255株细菌，比之前3篇研究发现的细菌总和都多，其中细菌原核古菌病毒数。（2）由于许多真菌孢子的粒径更多的介于2.510m，因此PM10中真核细胞的相对丰度和多样性均高于PM2.5中真核细胞多样性。（3）气溶胶中微生物宏基因序列结果与其他各种环境（泻湖、污泥、土壤等）中明显不同，相对与土壤中分布更接近。（4）原核生物中细菌丰度最高，且大多数与陆地、排泄物中细菌具有相关性。使用Metagenomic Phylogenetic Analysis方法建立细菌和古菌的系统多样性树。PM2.5中与排泄物相关的细菌比例随着PM2.5浓度升高有所提升。（5）丰度最高的细菌、真菌、病毒研究：发现48种细菌、2种真菌、3种病毒丰度最高，其中大多数在研究的7天中变化范围不大，PM2.5中Thermobifida fusca的丰度在PM2.5浓度升高时有所增加（6）PM2.5和PM10中的过敏原及致病菌：3种已经发现的过敏原及致病菌丰度均发现随着PM浓度的升高有所增加5 结论差的空气卫生造成的生物气溶胶污染已经给人们带来了各种不利的健康影响以及疾病的发生。此外，生物恐怖袭击等也逐渐威胁人类安全。目前，大体积生物采样，实时生物监测技术、生物气溶胶定量及控制以及疾病爆发于生物气溶胶暴露是当前生物气溶胶的研究方向。参考文献1 Agranovski I. E. (2010). Filtration of Liquid and Solid Aerosols on Liquid-Coated Filters. Aerosols: Science and Technology. I. Agranovski ed. Wiley-VCH, New York. pp. 315318.2 Beck J. D. Shang L. Li B. Marcus M. S. and Hamers R. J. (2008). Discrimination Between Bacillus Species by Impedance Analysis of Individual Dielectrophoretically Positioned Spores. Anal. Chem. 80:37573761.3 Foarde K. K. Hanley J. T. and Veeck A. C. (2000). Efficacy of Antimicrobial Filter Treatments. Ashrae. J. 42:52