《绿色荧光蛋白》PPT课件

绿色荧光蛋白将色彩引入生命科学研究,GFPBringtheColorstotheStudyforLifeScience,南京师范大学生命科学学院张朝,2011.11.9,绿色荧光蛋白的分子生物学及其应用,TheNobelPrizeinChemistry2008,forthediscoveryanddevelopmentofthegreenfluorescentprotein,GFP,OsamuShimomura,MartinChalfie,RogerY.Tsien,MarineBiologicalLaboratory,WoodsHole,MA,USA;BostonUniversityMedicalSchoolMassachusetts,MA,USA,ColumbiaUniversityNewYork,NY,USA,UniversityofCaliforniaSanDiego,CA,USA;HowardHughesMedicalInstitute,2008年诺贝尔化学奖获得者及其贡献,下村修，日本人，名古屋大学理学博士毕业后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。1962年从一种水母中发现了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。,钱永健，美籍华裔，现为美国加州大学圣迭戈分校生物化学及化学系教授、美国国家科学院院士、国家医学院院士，2004年沃尔夫医学奖得主。其主要贡献在于利用水母发出绿光的化学物来追查实验室内进行的生物反应，他被认为是这方面公认的先驱。,马丁沙尔菲，美国哥伦比亚大学生物学教授，他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。,1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(AequoreaVictoria)中分离出了GFP(Green-FluorescentProtein)。,绿色荧光蛋白的研究史,维多利亚水母(AequoreaVictoria),Atesttubecontainingasampleofacyan(greenish-blue)fluorescentproteinfromaseaanemoneilluminatedbyultra-violetlightfrombelow.,水母体内有一种发光蛋白Aequorin，它与钙离子结合时会发出蓝光，这道蓝光立刻被一种蛋白吸收，从而发出绿色萤光。这种捕获蓝光、发出绿光的蛋白质，就是GFP,水母发光蛋白发出的蓝光通过能量转移激发GFP发出绿光水母发光蛋白脱辅水母发光蛋白+氧化荧光素+蓝光绿色荧光蛋白绿光水母素在钙离子的刺激下发光，其能量可转移到GFP上，刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移（FRET）在生物中的发现。,钙离子,蓝光,发光过程,下村修,下村修因此成为首位从水母中分离出GFP，并发现这种蛋白质在紫外光下呈亮绿色的科学家，他被誉为生物发光研究的第一人,1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构。,绿色荧光蛋白的研究史,马丁沙尔菲,如果说下村修是绿色荧光蛋白的“接生婆”，沙尔菲则是绿色荧光蛋白的价值发现者。马丁沙尔菲等对实现GFP的基因表达做出了突出的贡献他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用。,绿色荧光蛋白的研究史,1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河。,钱永健,钱永健在改造GFP方面取得了卓越的成就。1995年，他完成的单点突变（S65T）显著提高了GFP的光谱性质，起荧光强度和光稳定性也大大增强。钱永健的主要贡献在于利用GFP来追踪追踪多种生物细胞进行的生物反应，他是这方面公认的先驱。,之后很快发现GFP能在多种异源细胞中表达，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮。1997年10月18-22日在美国New-Jersey专门召开了一次关于GFP的国际会议。,绿色荧光蛋白的研究史,2007年1月7日，东北农业大学刘忠华教授主持的转基因克隆猪课题获得成功。中国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪成功产下2头具有绿色荧光遗传特征的小猪。这是继美国、韩国、日本之后第四例成功通过体细胞核移植方式生出的绿色荧光蛋白转基因克隆猪。,绿色荧光蛋白的研究史,绿色荧光蛋白的结构解析,绿色荧光蛋白的结构解析,维多利亚水母GFP的cDNA编码区全长717nt,绿色荧光蛋白的结构解析,维多利亚水母GFP由238aa组成，分子量约27kD,绿色荧光蛋白的结构解析,GFP晶体结构显示,蛋白质中央是一个罐形结构,长420nm,宽240nm,由11个围绕中心螺旋的反平行折叠组成,荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,罐的顶部由3个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。,绿色荧光蛋白的结构解析,AtopologydiagramofthefoldingpatterninGFP.The-sheetstrandsareshowninlightgreen,a-helicesinblue,andconnectingloopsinyellow.Thepositionsinthesequencethatbeginandendeachmajorsecondarystructureelementarealsogiven.Theanti-parallelstrands(exceptfortheinteractionsbetweenstrands1and6)makeatightlyformedbarrel.,ThegreenfluorescentproteinGFPconsistsof238aminoacids,linkedtogetherinalongchain.Thischainfoldsupintotheshapeofabeercan.Insidethebeercanstructuretheaminoacids65,66and67formthechemicalgroupthatabsorbsUVandbluelight,andfluorescesgreen.,绿色荧光蛋白的罐形结构,绿色荧光蛋白的结构解析,Thedimercontactregion.Thetwopolypeptidechainsassociateoverabroadarea,withasmallhydrophobicpatch(intheyellowbox)andnumeroushydrophiliccontacts.Thetwo-foldsymmetryaxisisintheplaneofthepage,andismarkedbytheredarrow.Thepolarresiduesaremarkedwithredatomsforoxygenandbluefornitrogen.,绿色荧光蛋白的结构解析,绿色荧光蛋白的发光特性,GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。,绿色荧光蛋白的发光特性,GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似，因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合也适用GFP观察。尽管450490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测。GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450490nm蓝光波长下更稳定。,GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。但GFP对某些封片指甲油特别敏感。GFP荧光在pH7.0-12.0稳定，在pH5.5-7.0开始受到影响，高温(70)、极端pH或胍基氯化物条件下，GFP会变性，荧光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复。,绿色荧光蛋白的发光特性,GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保护。发色团（右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或丝氨酸）自发形成。,绿色荧光蛋白的发光基团,GFP荧光的产生主要归功于分子内第65、66、67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。,GFP荧光生色团,翻译出的蛋白质折叠环化之后,在O2存在下，分子内Gly67的酰胺对第Ser65的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基,Tyr66的2键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合。这样,GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团,该过程可以自动催化完成。,绿色荧光蛋白的发光基团,Stereoviewofthefluorophoreanditsenvironment.His148,Gln94andArg96canbeseenonoppositeendsofthefluorophoreandprobablystabilizeresonantformsofthefluorophore.Charged,polar,andnon-polarsidechainsallcontactthefluorophoreinsomeway.,绿色荧光蛋白的发光基团,Gln94,Arg96,ModelofthefluorophoreanditsenvironmentsuperposedontheMAD-phasedelectrondensitymapat2.2resolution.Thecleardefinitionthroughoutthemapallowedthechaintobetracedandsidechainstobewellplaced.ThedensityforSer65,Tyr66andGly67isquiteconsistentwiththedehydrotyrosine-imidazolidonestructureproposedforthefluorophore.Manyofthesidechainsadjacenttothefluorophorearelabeled.,绿色荧光蛋白的发光基团,目前对GFP的荧光发光机制还不清楚，Morise等人曾提出一个能量传递模式图来解释水母的发光机制，但并未获得认同。Chattoaj等对GFP进行了光谱分析，结合前人工作提出，GFP有两个明显的吸收带，对应于GFP的两种不同构象的基态A和B。基态A对应于395nm的吸收峰，基态B对应于475nm的吸收峰，基态A占优势，基态B的分子数量约是基态A的1/6，两种基态间能缓慢地转换，但激发态(*)之间的转换很快且发生了质子转移，A*快速高效地衰变至另一激发态，应该存在一个中间过度态I，质子转移使A*转变成I*,I*回迁到基态I时产生发射峰504nm的荧光，构象改变使I*转变成B*，由B*到B发射荧光而不发生质子转移。目前，对于GFP的作用机理较为认同的仅仅是：GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。,绿色荧光蛋白的发光机制,在离体状态下GFP对高温(70OC)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶(链霉蛋白酶除外)有较强抗性GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。,GFP的其他生化特性,GFP作为标记蛋白的优点,荧光稳定,检测方便,无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制,GFP对受体细胞基本无毒害,易于构建载体，不受假阳性干扰,不需任何反应底物和辅助因子,可制成永久标本,灵敏度高,GFP基因的改进,更换GFP生色团氨基酸改变碱基组成除去GFP基因中隐蔽剪接位点插人植物内含子更换强启动子等突变体GFP对密码子进行优化修饰增加荧光强度和热稳定性，促进了生色团的折叠,Zolotukhin等（1996）改变了wtGFP基因编码区中88个密码子中的92个碱基而用人类基因组中常用的密码子代替，将GFP的荧光强度提高22倍，适合在哺乳动物细胞中高效表达。,人工GFP,GuohongZhang等（1996）将GFP的荧光强度提高了35倍，转染16h24h后仍可稳定地测定荧光。,增强型GFP,将wtGFP中的Ser65用Thr替代，得到突变体。S65T-GFP，激发谱中只有一个峰，且红移至490nm，用蓝光即可激发RSFP，使之更适于普通荧光显微镜观察。,红移荧光蛋白,双突变体Y66H/Y145F能在381nm光的激发下产生445nm的蓝光，故称BFP。这种蓝光能进一步激发GFP产生绿光，即发生荧光共振能量转移现象（FRET）。,蓝色荧光蛋白,EBFP：增强蓝色荧光蛋白；ECFP：增强蓝绿色荧光蛋白EGFP：增强绿色荧光蛋白；EYFP：增强黄色荧光蛋白,绿色荧光蛋白变异体的发色基团结构,基于GFP的传感器,一种被修饰过的用来感应锌离子浓度的蓝色荧光蛋白：当红色的锌离子连接到蓝色的被修饰过的发色团上后，蛋白质会发出亮度增强一倍的荧光从而形成容易被检测到的可见信号。,CrystalstructureofaCu-boundgreenfluorescentproteinZnbiosensor,CrystalstructureofaZn-boundgreenfluorescentproteinbiosensor,锌离子GFP传感器,88mMFIP-CBSMand88mMCaM(panelsAC)88mMFIP-CBSMalone(panelsDF).,钙离子GFP传感器,pHtitrationsofGFPs.(A)FluorescenceandabsorbanceofGFP-S65TasafunctionofpH.DatawerefittedtoEq.1withpKaandnHparametersgiveninthetext.Forcomparison,fluorescencetitrationforfluoresceinisshown(-).(B)FluorescenceofGFP-F64L/S65T,GFP-Y66H,andGFP-T203IasafunctionofpHwithcurvefitsasinA.,pH-GFP传感器,GFP在生物研究中的应用,GFP在动物学研究中的应用,GFP作为新型报告基因用于转基因研究作为报告基因构建基因工程载体。以GFPS65T基因作为筛选标记的新型克隆载体，以绿白斑筛选法筛选阳性重组子，替代Lacz蓝白斑筛选，不需X一gal。GFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用HaleC.A.等利用GFP标记，研究了可溶性微管蛋白FtsZ与其内膜受体ZipA间的相互作用，发现，ZipA-GFP融合蛋白在细胞壁溢缩前和溢缩过程中均位于FtsZ与膜相关的特殊环中。,GFP作为一种新型免疫标记物利用GFP的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接观察，可望取代传统的标记技术，建立特异、灵敏、简便和快速的免疫诊断新方法。岳莉莉等成功地实现了gfp与HBVe抗原基因融合后在大肠杆菌和昆虫细胞中高效表达，得到既能发射荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种新型发光免疫诊断试剂奠定了基础。,GFP在动物学研究中的应用,GFP在植物研究中的应用,作为报告基因用于转基因植物研究GFP作为新型报告基因用于植物的遗传转化，可以替代与筛选有关的抗生素或抗除草剂标记基因，既优化植物遗传转化过程，又使转基因植物更安全。用于植物基因表达调控研究基因的表达可进行活体检测，利用GFP基因可以很方便地研究基因表达的时空性。Aspuria等(2002)将GFP与受生长素诱导的启动子重组后导入植物，用生长素诱导后，通过观察侧根的分生组织中是否有GFP的积累来证明生长素的时空表达。,Thephotographwastaken6dayspost-inoculationusingaDRHandLamp.Thegreenfluorescentspots(againstabackgroundofredchlorophyllfluorescence)showtheexpandingfociofvirus-infectedcells.,病毒介导的EGFP在烟草中的表达,RNAsilencingofgreenfluorescentprotein(GFP)(center)inleavesfromNicotianabenthamianaissuppressedbyananimal(left;B2proteinofflockhousevirus)oraplant(right)viralsuppressor,leadingtoenhancedGFPexpression(lightergreen/yellowareas).,GFP用于植物RNA沉默研究,用于植物信号转导研究GFP结合荧光共振能量转移(FREP)为研究植物信号转导也提供了新方法。例如：Allen等用YEP-GFP-Ca2+传感器检测拟南芥保卫细胞内Ca2+浓度的变化，结果表明，外源的Ca2+和ABA都能引起保卫细胞内Ca2+浓度的变化。这和过去用荧光染色法观察到的结果一致。,GFP在植物研究中的应用,GFP在微生物研究中的应用,GFP用于微生物与宿主相互作用研究利用GFP标记基因可以研究病毒、细菌和真菌等侵染植物的过程和机制。Bowyer等在小麦病原菌中构建了含异柠檬酸酶启动子的GFP基因，监测到T.yallundae侵染小麦时的碳代谢过程。GFP用于检测环境微生物的迁移Leff等将GFP克隆到基因工程菌中,监测其在水环境中的存活和去向。Scott等以GFP红移突变体作为标记基因,有效地追踪了乳酸细菌在复杂厌氧系统中的运移。,GFP在微生物研究中的应用,GFP微生物传感器将报告基因转入污染物代谢基因的启动子中可设计出生物传感器,当特定的污染物存在时即启动。Ikeno等分别以GFP和Ps作为报告基因和启动子，转入E.coli重组子中，用以检测水体中微量的苯衍生物。Roberto等以GFP作为报告基因，设计出可检测环境中亚微克级含量的砷和砷酸盐的生物传感器。,Moller等研究发现GFP标记的P.putidaRI细菌主要聚集在生物膜的表层，而Acinetobactersp.C6则附着在生物膜底层生长。,研究生物膜的生长特性及其菌落特性,C6:redR1:blue,GFP在微生物研究中的应用,GFP在真菌研究中的应用（1）GFP基因通过随机插入真菌基因组的方法,已经被成功地用来研究真菌的生态、生防菌对病原菌的侵染模式及病原菌与其寄主的关系等（2）GFP基因通过与目标基因融合的方法,则被广泛地用于真菌的基因转录规则、蛋白质及细胞器定位、细胞亚结构和蛋白质功能等研究.,GFP在生物医学中的应用,药物筛选利用GFP荧光探针，从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信号分子相似的，能引起配体-受体复合物迁移并介导生理反应的功能。如介导糖皮质激素受体（hGR)迁移药物的筛选模型的成功构建。用于临床检验示踪病原菌,GFP在肿瘤研究中的应用,GFP在肿瘤研究中的应用,GFP在蛋白质细胞定位中的应用,Animageofasinglemamaliancellwithgreen-to-redfluorescentDendramarkingfibrillarin,aproteinconcentratedinnucleoli,whicharesmall,roundbodiesinthecellsnucleus,composedofproteinandRNA.,科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑细胞的活动,随着病毒在宿主体内不断扩散，通过跟踪发出的绿光就可观察病毒的扩散途径；或者把它接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动。,a.线粒体；b.肌动蛋白；c.微管蛋白d.高尔基体；e.纽蛋白；f.组蛋白,LocalisationoftheERtargetedformofGFP,RootsfromArabidopsisplantstransformedwithaconstructcontainingthecyclinB1;1promoter,cyclinB1;1genefusedtoGFP.Cellsfluorescingingreenareinmitosis,GFP转基因生物,发绿光的老鼠,1997年7月日本大阪大学的科研人员首次培育出能够夜里发光的含有绿色荧光蛋白的老鼠。,1998年，EduardoKac通过转基因技术培育出第一条可以发出绿色荧光的狗。,发绿光的狗,转GFP基因的蜜蜂,转GFP基因的蝾螈（斑