《蛋白质的表达》PPT课件

AnExampleofproteininvestigation,Expressionofprotein,XuexiYang,人工合成尿素,自然界的矿物等无机物千年万年，亘古不变，是没有生命的；而有机物不同，是有生命的。无机物-有机物（生命）动植物体内存在着一种生命力，只有依靠这种生命力，才能产生出有机化合物，即有机物只能在有生命生物体内产生。化学家在实验室只能将有机物转化为新的有机物，而不能用无机物制造出有机物。,2NH4Cl+AgCNONH4CNO+AgClNH4CNO（热）（NH2）2CO,有机化学第一人-维勒（1800-1882）,蛋白质的生物合成,胰岛素有生物活性的蛋白质,Invitro：invitroproteinsynthesissystemProkaryoticExpressionSystem-E.coli,B.subtilisInvivoyeastEukaryoticExpressionSysteminsectcellsmammaliancells,.Expressionsystem,香蕉与奶牛,.ProkaryoticExpressionSystem,Escherichia.coli,becauseofthewealthofknowledgeregardingitsbiochemistryandgeneticscanbeconsideredagoodfirstchoiceforthepreparationofproteins.However,E.colimightnotyieldproteinsuitableforanalysis,thenothersystemsmustbeexamined,1.基因表达在原核生物与真核生物中的差别？,原核生物表达系统和真核生物表达系统具有各自的特点。在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5和3末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。,2.真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法,将真核基因克隆到1个强大的原核promotor和SDs的下游,使真核基因处于原核启动子的控制之下,转录物由于原核SDs能与核糖体rRNA结合,可在原核表达.这是克服1,2困难的好办法.从真核分离出mRNA并逆转录成cDNA,cDNA有完整的编码顺序,但无内含子是采用伪装办法将真核基因插到原核基因某密码之后,其翻译产物N端有原核多肽,这样表达的融合蛋白,可躲避细菌蛋白酶降解作用.,1.细菌RNApol不能识别真核的promotor,故真核基因不能被该酶转录.2.从真核转录的mRNA缺乏SD序列,不能结合到细菌核糖体rRNA,因此不能被翻译成蛋白.3.真核基因有内含子,而原核细胞缺乏真核细胞转录后加工系统,成熟的mRNA不能形成,不能表达真核蛋白;4.表达的真核蛋白在原核细胞中不稳定,易被细菌蛋白酶降解.,3.大肠杆菌表达载体的组件,复制起始点originofreplication选择性基因selectionmarker多克隆位点MCS启动子promoter终止子terminator核糖体结合位点ribosomebindingsite,ProkaryoticExpressionSystem,复制起始点,保证载体可以正确复制和增殖pBR322和pUC的复制起点，它们皆来源于ColE1质粒质粒具有不相容性通常表达载体都会选用高拷贝的复制子,选择性基因,至少有一个选择性基因，可用于转化体的确定，并可在培养过程中保持质粒的稳定性。LB倒板前加抗生素的温度超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢,多克隆位点,具有单一酶切位点的多克隆位点，便于外源基因的插入,3.1启动子,启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。-10区（pribnowbox）和-35区组成分类转录形式组成型诱导型强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。,Ptac=3Ptrp=11Plac,启动子,转录调控机理具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子CAP负调节因子lacI,IPTG诱导启动子-Lac,Lac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统,lacIPlaclacOlacZlacYlacA,lacIPlaclacOlacZlacYlacA,Lac表达系统正调节因子CAPcAMP激活CAP，CAPcAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与35、10序列的结合，进而促进Plac介导的转录。,基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5,Lac表达系统lacUV5突变体PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。,Lac表达系统负调节因子lacI在无诱导物情形下，lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。,lacIPlaclacOlacZlacYlacA,lacIPlaclacOlacZlacYlacA,转录调控机理色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达,IAA诱导启动子-Trp,Trp表达系统以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统,Trp表达系统,Tac表达系统tac启动子是由trp的35序列和lacUV5的10序列拼接而成的杂合启动子。调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。,杂合启动子-Tac,PL和PR表达系统以l噬菌体早期转录启动子PL、PR为核心构建的表达系统在野生型l噬菌体中，PL、PR启动子转录与否决定了l噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。,温度诱导启动子-PL和PR,PL和PR表达系统转录调控的机理由l噬菌体PE启动子控制的cI基因的产物是PL、PR启动子转录的阻遏物。cI基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI基因产物的产生和消失是相当困难的。因此PL、PR表达系统都选用温度敏感突变体cI857(ts)的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。在较低温度（30）时以活性形式存在在较高温度（42）时失活脱落,T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。,最常用启动子-T7,T7表达系统T7噬菌体编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。,T7表达系统转录调控的机理T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。,T7表达系统转录调控的机理化学诱导型噬菌体DE3是l噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。,T7RNA聚合酶基因,lac启动子,E.Coli（DE3）,IPTG诱导,T7表达系统转录调控的机理温度诱导型PL启动子控制T7RNA聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。,T7RNA聚合酶基因,PL启动子,E.Coli（CE6）,热诱导,cI857,T7表达系统转录调控的机理双质粒系统一个质粒带有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒带有T7启动子和目的基因两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型,热诱导,3.2TheTerminator,StopsRNAsynthesisatspecificpointsalongtheDNAtemplateTheenzymestopspolymerisingnucleotidesintoRNA,releasestheRNAchainandleavestheDNAtoeventuallyreinitiateatanotherpromoter.Features:AdyadsymmetryintheDNA,centered15to20nucleotidesbeforetheendoftheRNAthisleadstoatranscriptthatcanformanhairpinloopRunofaboutsixAsintheDNAtemplatewhicharetranscribedintoUsattheendoftheRNA,Howcouldthesetwostructuralfeaturescausetermination?,强化转录终止的必要性外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率,终止子,强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用,终止子,核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）,3.3核糖体结合位点,核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的68个核苷酸序列5UAAGGAGG3即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3端区域3AUUCCUCC5并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5端若干密码子的碱基序列,核糖体结合位点,4.常见原核表达系统,面面俱到Novagen因为纯化爱上你-GE（原安玛西亚）更快克隆Invitrogen,面面俱到Novagen,面面俱到Novagen,是否要用基因本身的起始密码子进行选择是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体你希望用蓝白斑筛选可以使用pETBlue系列载体除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接的克隆方式Novagen提供菌株种类多种菌株:BL21,Rosetta,Origami除了常用培养基LB、TB、M9、M9ZB等：可以直接进行过夜培养培养基OvernightExpressAutoinductionSystemNovagen还有表达双外源蛋白的载体pCDFDuet-1DNA、pETDuet-1DNA、pRSFDuet-1DNA：最多可以同时表达8个外源蛋白有许多不同系列的载体、菌株供选择；与原核表达的各种相关产品都一应俱全：载体、菌株、培养基、检测表达的抗体、纯化产品,抗性和标签,BL21:lon,ompTBL21(DE3):T7polymeraseRosetta:optimalcodonsOrigami:thioredoxinreductase(trxB),glutathionereductase(gor)Rosetta-gamiOrigamiB:(IPTGconcentrationdependent),菌株种类,菌株种类,蛋白酶缺陷型都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型，这包括有BL21,Origami,Rosetta。可以保持蛋白的稳定不被降解。保证所有细胞以同样量进行表达OrigamiB和Rosetta这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。蛋白表达浓度可以随着IPTG浓度而改变。通过对IPTG浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。二硫键形成与溶解性增强Novagen专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺陷型的，包括BL21trxB，Origami，OrigamiB和Rosetta-gami。可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。稀有密码子的补给Rosetta是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA。硒蛋氨酸标记B834是来源于BL21的蛋氨酸（met）营养缺陷型菌株。它在高度特异活性35S-met标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,作为蛋白纯化的专家,GE的原核表达系统以便于产物纯化而见长。融合表达系统的pGEX是我们极为熟悉的GST亲和纯化表达系统,其表达产物纯化体系已经非常成熟。选择表达系统的时，表达后的纯化方法是必需考虑的非常重要的问题。,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,通用电气医疗集团(GEHealthcare)安玛西亚：ECL，Sepharose、Sephadex,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,GST是一个高度可溶的蛋白，可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到一种促进表达量提高的作用。对于表达分子量小的目标蛋白来说选择GST就比6xHistag更有优势GST纯化填料的专一性则非常高,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,GST系列总共有13个载体。有9个的多克隆位点是扩展过的，有6个限制性酶切位点。载体上都有将GST切割下来的蛋白酶识别位点，可以分成T系列、X系列和P系列，分别采用凝血酶Thrombin、Xa因子蛋白酶以及GE的PreScission蛋白酶。pGEX所有载体都提供了三种不同的翻译读码框选择；都是利用乳糖操纵子调控模式，启动子都是Ptac。,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,在表达后的检测和纯化方面，GE医疗的产品堪称经典：WesternBlot检测表达，纯化亲和层析柱，即使GE医疗没有6组氨酸标记的载体，但是6组氨酸亲和纯化相关产品却绝对出色纯化是表达后绝对不可小视的一步。所以，“因为纯化爱上你”，就是选择pGEX的最好理由吧！,更快克隆Invitrogen,Invitrogen是TA克隆的创始者定向TOPO克隆完全不需要酶切和传统连接反应，五分钟就可以做出一个克隆。其他载体主要用传统的酶切、链接方式做重组质粒，Invitrogen的表达系统大量运用TOPO技术和Gateway技术Invitrogen有四个原核表达系统：ChampionpETExpressionSystem、HisPatchThioFusionSystem、pBADInducibleBacterialSystem、pLSystem和T7-basedSystems。几乎囊括所有启动子。,5.表达前的分析比什么都重要,翻译起始位点GC含量二级结构基因或者蛋白的大小亲疏水性,成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。,6.避免外源基因表达蛋白降解的对策,构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统,7.大肠杆菌表达研究四重境界,初次尝试扫盲篇乱棍打枣入门篇系统优化中级篇自成一体高手篇,EukaryoticExpressionSystem,1.YeastExpressionSystems2.BaculovirusExpressionSystems3.AnimalcellsExpressionSystems,1.酵母表达系统,酵母表达系统既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点。最先被研究和应用的是酿酒酵母体系，但酿酒酵母系统由于缺乏强有力的启动子、分泌效率差、表达质粒易于丢失等缺点，逐渐被甲醇酵母表达系统代替，其中毕赤酵母应用最为广泛。,1.1毕赤酵母表达系统的特点,优点：1）含有强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。3）发酵工艺成熟。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺,1.1毕赤酵母表达系统的特点,缺点：利用易燃的甲醇做原料，表达产物的卫生安全性需要考虑筛选药物价格昂贵也给生产应用带来局限信号肽加工不完全，修饰功能欠完善以及内部降解等现象，给外源蛋白的纯化和工业化带来了困难。,1.2甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,甲醇酵母（methylotrophicyeast)指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。毕赤酵母（Pichiapastoris)汉森酵母（Hansenulaploymorpha)假丝酵母（Candiaboidinii),1.2甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,甲醇氧化酶启动子A、目前已发现的、最强的真核启动子B、严谨调控型启动子AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导,1.3毕赤酵母表达系统模式载体,1.4选择标记,营养缺陷型选择标记His4、Ura3、Leu2抗性选择标记G418、Amp,2.杆状病毒表达系统,杆状病毒只来源于无脊椎动物。基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80160kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒多角体基因缺失后，并不影响后代病毒的感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的功能。,杆状病毒表达系统的原理,NPV基因组巨大，不适于体外操作，需构建一个能与NPV基因组DNA重组的转移载体质粒。转移质粒载体上含有多角体蛋白基因的启动子及多角体蛋白基因的旁侧序列。将目的基因克隆至转移载体的多接头的合适酶切位点处，使其处于多角体基因启动子的控制之下。重组转移载体与野生型病毒DNA共转染昆虫细胞，目的基因通过细胞内同源重组而插入病毒基因组中。利用空斑形态的差异进行筛选、纯化重组病毒，再以纯化的重组病毒感染昆虫细胞，即可获得大量的外源基因表达产物。,杆状病毒表达系统的特点,重组蛋白具有完整的生物学功能：表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。能进行翻译后的加工修饰：修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致，但修饰的寡糖种类却不完全一样。表达水平高：与其它真核表达系统相比，最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可达到细胞总蛋白的50。能容纳大分子的插入片段：能同时表达多个基因：既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。不足：非连续性表达；表达产物的糖基化相对简单，多不分支。,与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。与大肠杆菌相比，哺乳动物细胞的表达水平低、获得高表达细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等导致哺乳动物细胞生产蛋白质的成本较高。,3哺乳动物细胞表达系统,表达需要转录后修饰的基因研究蛋白的生物合成和体内细胞间的转运机制表达大肠杆菌和酵母不能表达的含有内含子的基因序列哺乳动物细胞是最理想的表达人类基因的系统，应为首选。,哺乳动物细胞表达系统,体外翻译系统（Invitrotranslationsystem）又称之为体外蛋白质合成系统(invitroproteinsynthesissystem)，是一种细胞裂解物，这种系统只有翻译功能，当加入外源mRNA，能量物质和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经SDSPAGE后可检测出翻译活性。常用翻译系统有以下几种：1.兔网织细胞裂解物(reticylocytelysatesystem)2.小麦胚抽提物(wheatgermextract)3.两栖动物卵母细胞4.原核体外翻译系统,体外翻译系统,Commonlyconfrontedquestions,Shouldtheprotein(s)beexpressedinbacteria,inyeast,ininsectcellsorinhumancells?Whichexpressionvectorshouldbeused?Ifbacterialexpressionisused,whichstrain(s)shouldbechosen?Shouldoneexpressthefulllengthproteinorafragmentthereof?Shouldtheproteinbetagged,andwhichaffinitytagisthebest?Whatisagoodpurificationstrategy,andwhatarethecommonpitfalls?,Unfortunately,becauseeveryproteinisdifferent,therecanbenorightanswertoanyofthesequestionsapriori.,Howtochooseproteinexpressionsystem,Choiceofhost(system)ChoiceofvectorChoiceoftagChoiceofstrains,1.Choiceofhost,bacteria,fungi,plants,insectormammaliancellsgrowninculture,andtransgenicanimalsorplants“MyExpressionSystemisBetterthanYours”Syndrome-Thereisnooneexpressionsystemthatdoeseverythingwell,Eachsystemhasitsstrengthsandweaknesses,Theamountandthedegreeofpurityoftheproduct,aswellasitsbiologicalintegrityandpotentialtoxicityshouldbeconsidered.TheexpressionofeachcDNAorgenepresentsitsownpeculiarsetofproblems.Thesynthesisofforeignproteinisstilllargelyempirical.,2.Choiceofvector,Thechoiceofvectorfamilyislargelygoverne