石斛中多糖含量的测定

陕西理工学院毕业论文题 目 石斛中多糖含量的测定 学生姓名 高 换 楼 学号 所在学院 化学与环境科学学院 专业班级 化工1102班 指导教师 季 晓 晖 完成地点 陕西理工学院 2015 年 06 月 08 日石斛中多糖含量的测定高换楼（陕西理工学院 化学与环境科学学院 化工专业1102班，陕西 汉中 ）季晓晖摘要 石斛为我国常用贵重药材，有养阴清热、益胃生津的功效，石斛一直备受国内外研究者的重视。本文利用蒽酮-硫酸法对铁皮石斛多糖的含量进行了测定，并采用正交试验得到最佳实验方案，在石斛粉碎程度为粉末、液料比为50mL/g、提取2次，每次3小时的情况下多糖提取率最高。本文的实验结果为今后铁皮石斛多糖提取的质量评价及其进一步开发和利用提供参考依据。关键词 石斛；多糖；蒽酮-硫酸法；抗氧化性；测定；Determination of Dendrobium polysaccharide contentGAO Huanlou（Grade 02, Class 11, Major chemical engineering, School of chemical and environmental science Dept, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 72300x, Shaanxi）Tutor: JI XiaohuiAbstract: Dendrobium is in common use in our country precious medicinal herbs, the effect of nourishing yin and clearing heat, nourishing stomach fluid, Dendrobium has attracted a lot of attention of researchers at home and abroad. The anthrone-sulfuric acid method of Dendrobium officinale polysaccharide content were measured, and using the orthogonal test and the optimum solution is obtained. In Dendrobium degree of comminution is in the form of powder, liquid to solid ratio for 50mL/1g, extraction 2 times, every time 3 hours of polysaccharides extraction rate was the highest. The experimental results for the quality evaluation of future Dendrobium officinale polysaccharide extraction and its further development and utilization to provide reference.Key words: Dendrobium; polysaccharide; anthrone-sulfuric acid method; antioxidation; determination;目录1论文综述11.1石斛生物碱11.2石斛多糖11.3铁皮石斛的其他化学成分31.3.1氨基酸类51.3.2微量元素51.3.3木脂素类51.3.4酚酸类51.3.5苯丙素类61.3.6芪类其衍生物61.3.7菲类和联苄类化合物71.4石斛的药理作用71.4.1增强机体免疫作用71.4.2抗氧化作用71.4.3抗肿瘤作用71.4.4抗疲劳作用81.4.5降血糖作用81.4.6生津作用81.4.7其他药理作用82实验82.1材料和试剂、仪器82.1.1仪器82.1.2材料及试剂92.2试验方法92.2.1预处理与纯化过程92.2.2样品制备及试剂配制92.2.3测定92.2.4铁皮石斛多糖抗氧化性测定102.2.5多糖提取的正交试验102.2.3计算112.2.5结果与分析113结论134外文翻译171论文综述石斛是我国传统常用名贵中药材，为兰科（Orchidaceae）石斛属（DendrobiumS.w）多种植物的干燥茎的统称。在我国已有2000多年的药用历史，早在神农本草经、本草纲目等著作中就有记载，并列居上品。著名的有金钗石斛（D.nobile Lindl）、铁皮石斛（D.officinale Kimura et Migo）、霍山石斛（D.huoshanense）1等。目前我国76种石斛属植物中，有近40种被作为药用。传统中医常将其用于滋阴清热、生津益胃、止咳润肺、清音明目等2。现代药理研究表明石斛具有多种医药功效，可预防和治疗白内障、增强免疫功能、治疗肿瘤、降血糖、抗氧化等，在临床中应用相当广泛。化学成分分析显示，药用石斛所含的化学成分类型多样，包括生物碱、多糖、菲类、联苄类、黄酮类、倍半萜类、香豆素、甾体及挥发油等3。1.1石斛生物碱生物碱是石斛药材中最重要的活性成分之一，也是最早分离并进行结构确认的化合物。1932年，日本人铃木秀干在中药金钗石斛（D.nobile）中首次分离获得一种生物碱，命名为石解碱（Dendrobine）4。1935年，陈克恢等再次在金钗石斛中分离得到石斛碱，并测定金钗石斛中总生物碱的含量为0.52%5。1964年，犬伏康夫等确定石斛碱具有倍半萜骨架结构6。迄今为止，已经从16种石斛属植物分离得到32种生物碱，主要骨架共分为四大类即石斛碱型、八氢中氮茚型、四氢比咯型和咪唑型7。石斛碱型石斛碱是石斛属植物中存在最多的一类重要生物碱，共有19种；其基本骨架是含有15个C的picrotoxane型倍半萜；它含有一个五元内酯环，N与picrotoxane倍半萜的2位与11位形成五元杂环，N上通常连有甲基等官能团。按其骨架结构变化，石斛碱型石斛碱又分为七种骨架类型7-10。1997年，台湾学者Sha等首次通过-羰基游离基环化反应全合成了纯手性的石斛碱（）-dendrobine8。2000年，日本学者Morita等从金钗石斛中分离得到一种很少见的五元内酯开环的石斛碱型生物碱Mubironine C（C17H29O3N），其15位与3位的内酯断开。八氢中氮茚（octahydroindolizone）类7,10-12石斛碱是一种含有一个氮原子的五元和六元并环体系的生物碱，该类生物碱共有6种。四氢比咯型7,13-16生物碱共有5种，Leete等用放射性标记化合物114C-醋酸钠和4,214C邻琥珀酰基苯甲酸加入报春石斛的生长过程，发现114C-醋酸钠中的14C主要存于该类石斛碱的第5位C上，提出琥珀酰苯甲酸是其合成前体，Breuer等16以邻羧基苯基环丙酮为原料水解得到了一种四氢比咯型生物碱石斛宁（shihunine）。咪唑型17,18生物碱有一个典型的咪唑环结构，该类生物碱有2种，1993年，Hemscheidt等18根据标记的3C和15N研究其生物合成途径，推测该类生物碱可由D,L-赖氨酸生物合成。前期研究报道，铁皮石斛的生物碱含量只有金钗石斛的1/201。金钗石斛含较多生物碱，其一年生含量最高，为0.5489%，随年份增加，其含量依次减少;铁皮石斛中几乎不含生物碱，三年生最高也仅含0.0121%3。此外，文献报道野生石斛茎叶中总生物碱的含量仅有0.3%2，文中发现人工培植的金钗石斛中总生物碱含量高于野生品种，为0.5489%，因此，预测人工培植品将可替代野生品。铁皮石斛中总生物碱含量较低，诸燕等19研究发现，人工栽培的铁皮石斛与市场购买的铁皮枫斗药材总生物碱在0.0190%0.0430%；浙江省11个铁皮石斛种质一年生、二年生、三年生样品平均总生物碱为0.0253%、0.0270%、0.0326%，云南产一年生铁皮石斛平均总生物碱为0.0343%。1.2石斛多糖石斛多糖是石斛类中药材的主要有效成分，为大分子化合物，是铁皮石斛的主要药效成分。目前对中药多糖的分析以含量和单糖组成分析为主，特别是后者，在分析仪器的普及、色谱及色谱联用技术的发展等因素的推动下，已经成为2010年版药典铁皮石斛质量标准的检测方法之一。多糖类成分的化学结构复杂：一级结构主要反映糖链的糖基组成、各种组成单糖的分子数比例、单糖残基的构型、残基之间的连接次序等内容，单糖残基的排列顺序对多糖的活性有影响；二级结构反映多糖骨架链的构象；三级结构反映了单糖残基中各官能团之间非共价作用形成的有序、规则而粗大的空间构象；四级结构指多聚链间非共价键结合形成的聚集体。多糖的高级结构与其生物学功能密切相关。目前铁皮石斛多糖研究以含量测定和一级结构研究为主，在此基础上2010年版中国药典制定了专属性更强的铁皮石斛鉴别和含量测定方法；同时，铁皮石斛多糖的指纹图谱分析、高级结构、构效关系、生物化学等方面的研究还有待继续深入地开展。相信随着色谱、电泳等现代分离技术的发展，质谱技术在生物大分子质量与结构分析中、色谱-质谱联用技术在化学成分定性、定量分析中的广泛应用，铁皮石斛多糖的活性成分及结构功能通过相关药效学的研究将能够得到明确的界定。在此基础上，铁皮石斛的质量标准会有质的提高20。多糖其含量多少是评价药材品质的重要指标之一。王建21等人的实验结果显示，广西6个产地的马鞭石斛中多糖的含量差异较大，其中以田阳县的马鞭石斛的多糖含量最高，达11.85%，其他产地的马鞭石斛多糖含量分别为10.93%、10.08%、4.18%、4.39%、5.20%。因石斛为多年生植物，有效成分的积累与其生长年限、生长环境等都存在着密切的联系。不同产地的马鞭石斛之间多糖含量差别较大，可能与以上因素有一定的关系。诸燕等19研究浙江人工栽培的铁皮石斛，发现二年生铁皮石斛多糖平均质量分数达34.47%；不同种质、生理年龄的铁皮石斛多糖质量分数存在显著差异。李彩霞20比较不同采收期铁皮石斛多糖含量，春季（3月）、夏季（6月）、秋季（9月）和冬季（12月）的铁皮石斛多糖含量分别为4.59%、5.37%、5.92%和6.24%，以冬季采收为佳。尚喜雨23对铁皮石斛的组培苗、野生植株、栽培植株中多糖的含量及分布进行系统分析和研究，发现铁皮石斛的多糖含量很高，尤以茎段为最多；不同部位的含量存在一定差异，茎部的差异大于根和叶；人工栽培的两年生植株的多糖含量比一年生的多，野生型的比栽培型的多；杀青后烘干处理可以有效地减少多糖在处理过程中的损失。在前人研究基础上，近10年从铁皮石斛中分离得到更多的多糖。杨虹等24分离得到两个多糖，即DT2和DT3，分子量分别为7.410.5和5.410.5；DT2和DT3的结构主要以-（14）-D-Glc缩合而成，末端糖为1Gal，1Glc及1Ara，葡萄糖和半乳糖上含有少量的分支，并含少量的木糖、阿拉伯糖和甘露糖。Hua等25分离得到一个结构为O-乙酰葡萄甘露聚糖类型的多糖，主链由-（14）-甘露型吡喃糖基和-吡喃葡萄糖基重复构成，支链由（13）-甘露糖基、（13）-葡萄糖基和少量的阿拉伯呋喃糖基组成，支链连接在主链末端糖基的6位上；（14）-甘露糖基和葡萄糖基的2位被乙酰化；单糖组成为甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖按40.28.41的摩尔比例组成。何铁光等26从铁皮石斛原球茎分离得到均一组分多糖DCPP3c-1，相对分子质量为72.4，由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其分子物质的量之比为1.120411.04623.3543.8281.046，DCPP3c-1中16键连接的残基占14.0%，12或14键连接的残基占40.7%，13键连接的残基占45.3%。铁皮石斛多糖的结构特点见表1.127。表1.1 从铁皮石斛中分离得到的多糖序号多糖名称分子量单糖组成参考文献黑节草多糖0甘露糖型吡喃糖、露糖型吡喃糖、喃糖、葡萄糖、其他戊糖28黑节草多糖0甘露糖型吡喃糖、露糖型吡喃糖、喃糖、葡萄糖、其他戊糖28黑节草多糖2甘露糖型吡喃糖、露糖型吡喃糖、喃糖、葡萄糖、其他戊糖282-O-乙酰葡萄糖甘露聚糖甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖（40.48.41）29DT2葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖（5.91.00.80.5）30DT3葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖（7.91.31.00.50.7）30DCPP1a-1甘露糖、葡萄糖（7.0151）31多糖含量测定的方法有很多。一类是利用多糖的还原性，如3,5-二硝基水杨酸盐比色法和Somogyi-Nelson法；另一类是普遍使用的利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质这一性质进行测定，如苯酚-硫酸法和蒽酮硫酸法32。苯酚-硫酸法是常用测定多糖含量的方法，可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单、灵敏度高，试验时基本不受蛋白质存在的影响。蒽酮-硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物，所以用该法测出的多糖含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。1.3铁皮石斛的其他化学成分利用先进的检测技术对中药材或其来源植物的化学成分进行定性和定量分析，并结合多元统计分析的方法实现对中药的基源鉴定20，陈晓梅等利用此方法对铁皮石斛茎中分离鉴定，其中所含化合物如表1.2所示。表1.2 铁皮石斛茎中分离鉴定的化合物化合物类别化合物成分参考文献芪类铁皮石斛素 Adendrocandin A33铁皮石斛素 Bdendrocandin B33铁皮石斛素 Cdendrocandin C34铁皮石斛素 Ddendrocandin D34铁皮石斛素 Edendrocandin E34铁皮石斛素 Fdendrocandin F35铁皮石斛素 Gdendrocandin G35铁皮石斛素 Hdendrocandin H35铁皮石斛素 Idendrocandin I354,4-二羟基-3,5-二甲氧基联苄4,4-dihydroxy-3,5-dimethoxybibenzyl333,4-二羟基-5,4-二甲氧基联苄3,4-dihydroxy-5,4-dimethoxybibenzyl333-羟基-3,4,5-三甲氧基联苄3-O-methylgigantol334,4-二羟基-3,3,5-三甲氧基联苄dendrophenol333,4-二羟基-5-甲氧基联苄3,4-dihydroxy-5-methoxybibenzyl363,4-二羟基-3,5-二甲氧基联苄gigantol33二氢白藜芦醇dihydroresveratrol36dendromoniliside E36denbinobin362,4,7-三羟基-9,10-二氢菲2,4,7-trihydroxy-9,10-dihydrophenanthrene364,5-二羟基-3,3-二甲氧基联苄4,5-dihydroxy-3,3-dimethoxybibenzyl372,3,4,7-四甲氧基菲2,3,4,7-tetramethoxyphenanthrene381,5-二羧基-1,2,3,4-四甲氧基菲nakaharain382,5-二羟基-3,4-二甲氧基菲2,5-dihydroxy-3,4-dimethoxyphenanthrene382,7-二羧基-3,4,8-三甲氧基菲Confusarin382,5-二羧基3,4-二甲氧基菲nudol383,5-二羧基-2,4-二甲氧基菲bulbophyllanthrin38酚类N-p-香豆酰酪胺paprazine39反-N-(4-羟基苯乙基)阿魏酸酰胺moupinamide39二氢松柏醇二氢对羟基桂皮酸酯dhydroconiferyl dihydro-p-cumarate39二氢阿魏酰酪胺dihydro-feruloyltyramine39对羟基苯丙酰酪胺p-hydroxyphenylpropionyl tyramine39丁香酸syringic acid39丁香醛syringaldehyde39香草酸vanillic acid39对羟基苯丙酸p-hydroxy-phenylpropionic acid37,39对羟基桂皮酸p-hydroxy cinnamic acid37,39阿魏酸ferulic acid39对羟基苯甲酸4-hydroxybenzoic acid39松柏醇3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propen-1-ol37香草醇4-hydroxy-3-methoxybenzyl alcohol37穆坪马兜铃酰胺N-trans-feruloyl tyramine37顺式阿魏酰对羟基苯乙胺37反式桂皮酰对羟基苯乙胺37木质素类(+)-丁香脂素-O-D-吡喃葡萄糖苷(+)-syringaresinol-D-glucopyranoside40Icariol A2-4-O-D-glucopyranoside40(+)-lyoniresinol-3a-O-D-glucopyranoside40裂异落叶松脂醇()-secoisolariciresinol40左旋丁香脂素()syringaresinol37,40丁香脂素-4,4-O-双-D-葡萄糖苷syringaresinol-4,4-O-bis-D-glucoside40二氢丁香苷Dihydrosyringin39酚苷类koaburaside393,4,5-三甲氧基苯基-1-O-D-芹糖-(12)-D-葡萄糖苷khaephuouside404-羟基-2,6-二甲氧基苯基葡萄糖苷leonuriside A402-甲氧基苯基-1-O-D-芹糖-(12)-D-葡萄糖苷2-methoxyphenyl-1-O-D-apiofuromosyl-(11-ap-D-glucopyranoside404-烯丙基-2,6-二甲氧基苯基葡萄糖苷37金盏花苷Erigeside ,dictamnoside A39核苷类腺苷adenosine36尿苷uridine36鸟苷guanosine36内酯类钩状石斛素aduncin36洋地黄内酯,金盏菊花素digiprolactone,calendin36黄酮类柚皮素,4,5,7-三羟基二氢黄酮naringenin37,393,5,5,7-四羟基二氢黄酮3,5,5,7-tetrahydroxyflavanone39甾类胡萝卜苷daucosterol36-谷甾醇-sitosterol36脂肪酸酯反式阿魏酸二十八烷基酯n-octacostyl ferulate36对羟基反式肉桂酸三十烷基酯defuscin36对羟基顺式肉桂酸三十烷基酯n-triacontyl cis-p-coumarate36脂肪酸十六烷酸hexadecanoic acid36十七烷酸heptadecanoic acid36脂肪醇三十一烷醇hentriacontane36苯丙素苷（1R）-1-（4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙醇-4-O-D-葡萄糖苷(1R)-1-(4-hydroxy-3,5-dimethoxylphenyl)propan-1-ol-4-O-D-glucopyranoside40糖类蔗糖sucrose36其他5-羟甲基糠醛5-hydroxymethyl-furaldehyde36在植物化学研究方面，李燕等33-35,37,41从铁皮石斛茎中分离鉴定了27个联苄类化合物。杨莉等42报道，用HPLC分析了31种石斛属植物（不包括铁皮石斛）中的11个酚性成分（包括联苄化合物5个，菲和芴酮化合物各3个），发现联苄化合物在石斛属植物中普遍存在，其中3,4-二羟基-3,5-二甲氧基联苄（gigantol）和4,4-二羟基-3,3,5-三甲氧基联苄（moscatilin）在检测植物中的分布最广。陈晓梅等43分析了包括铁皮石斛在内的24种石斛属植物62份样品的化学成分，得到了类似的结果，并发现野生铁皮石斛的联苄含量高于人工栽培的，说明人工栽培铁皮石斛中小分子化学成分的积累与野生铁皮石斛的存在差别。联苄成分在铁皮石斛样品中的含量均较低，3,4-二羟基-4,5-二甲氧基联苄的平均含量最高，仅为0.05；且目前还没有关于该化合物药理活性研究的报道。研究联苄成分与铁皮石斛功效的关系，将有助于明确铁皮石斛的药效成分，提高药材的质量控制标准。根据陈晓梅等43的报道，采集自云南省、浙江省和贵州省的12个铁皮石斛样品中均能检测到柚皮素（4,5,7-三羟基黄烷酮，naringenin）和3,4-二羟基-4,5-二甲氧基联苄。此外，这两个成分在石斛属植物中也有较广泛的分布：柚皮素在20种植物的56份样品中存在；3,4-二羟基-4,5-二甲氧基联苄在13种植物的40份样品中存在。以植物样品中柚皮素、3,4-二羟基-4,5-二甲氧基联苄、gigantol和moscatilin等4个化合物含量、多糖含量、以及多糖的单糖组成中甘露糖和葡萄糖相对含量比（M/G）为预测变量，利用多元统计分析的判别分析（discriminant analysis）建立判别函数，能将铁皮石斛与4种近似植物：晶帽石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛和束花石斛完全区别开来。这一结果同时说明柚皮素、联苄和多糖等化学成分对石斛属植物的鉴别有重要意义。引入多种类型化学成分的指标进行判别分析，有助于提高研究对象分类的准确性。1.3.1氨基酸类铁皮石斛含有天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸等16种氨基酸，前5种占总氨基酸的53，含有除色氨酸以外的所有人体必须的氨基酸44。人工培养铁皮石斛圆球体及分化苗中含有除上述16种氨基酸外，还含苯丙氨酸，其中7种是人体必需但又不能自身合成的氨基酸45。1.3.2微量元素诸燕等19测定铁皮石斛中11种金属元素含量，发现铁皮石斛中钾、钙、镁、锰、锌、铬和铜平均质量分数分别为1205.23、766.82、158.25、31.06、4.28、8.28、0.97mg/kg，砷、汞、铅和镉4种重金属元素含量，除1个样品镉元素超过限量指标0.07mg/kg外，均在规定限度范围内，并且种质与生理年龄对金属元素的积累存在显著影响46。在人工铁皮石斛、原球茎组织培养物、铁皮枫斗与铁皮石斛胶囊中，10种主要微量元素Cu、Zn、Fe、Mn、Ca、Mg、K、Cr、Sr、B含量非常相近47。且原球茎组织培养物的9种微量元素（除Cu外）含量均最高。由此提示，以滋补作用为研究方向，铁皮石斛具有巨大的开发价值。1.3.3木脂素类已报道44,48(+)-丁香脂素-O-D-吡喃葡萄糖苷、icariol A2-4-O-D-glucopy-ranoside、(+)-lyoniresinol-3a-O-D-glucopyranoside、裂异落叶松脂醇、丁香脂素-4,4-O-双-D-葡萄糖苷和丁香脂素等木脂素类化合物。1.3.4酚酸类已报道41,48-51koaburaside、丁香酸、丁香醛、香草酸、对羟基苯甲酸、松柏醇、香草醇、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯基葡萄糖苷、2-甲氧基苯基-1-O-D-芹糖-(12)-D-葡萄糖苷、3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-D-芹糖-(12)-D-葡萄糖苷和(1R)-1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙醇-4-O-D-葡萄糖苷等酚酸类化合物。1.3.5苯丙素类已发现41,48(E)-对羟基苯丙酸、对羟基桂皮酸、反式桂皮酸酰对羟基苯乙胺、顺式阿魏酸酰对羟基苯乙胺、阿魏酸、dictamnoside A、反式阿魏酸二十八烷基酯、对羟基反式肉桂酸三十烷基酯、对羟基顺式肉桂酸三十烷基酯、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯基葡萄糖苷和二氢松柏醇二氢对羟基桂皮酸酯等苯丙素类化合物。1.3.6芪类其衍生物从石斛中分离出来的芪类化合物主要包括联苄、二氮杂菲等，其药理活性主要为抗肿瘤。目前从铁皮石斛中分离鉴定的芪类化合物有：双苄酚类及菲酚类化合物毛兰素（erianin）和鼓槌菲（chysotoxene）；菲醌母核金钗石斛菲醌（denbinobin）52；联苄类化合物dendrocandinA，dendrocandin B，dendrocandin C，dendrocandinD和dendrocandin E534,4-dihydroxy-3,5-dimethoxybibenzyl，3,4-dihydroxy-5,4-dimethoxybibenzyl，3-O-methylgigantol，dendrophenol和石斛酚（gigantol）54。上述化合物结构特点见表1.3、图1.1。表1.3 铁皮石斛中芪类化合物结构类型化合物名称结构参考文献菲酚类chysotoxene55联苄类Erianin55菲醌类denbinobin52联苄类dendrocandin A：R1=R2=OH.R3=R5=R6=OCH3.R4=H53联苄类dendrocandin B53联苄类dendrocandin C：R1=R2=R5=OH,R3=R6=OCH3.R4=H54联苄类dendrocandin D：R1=R2=R5=OH,R3=OCH3,R6=OCH3,R4=H54联苄类dendrocandin E：R1=R2=R4=R5=OH,R3=OCH3,R6=H54联苄类4,4-dihydroxy-3,5-dimethoxybibenzyl：R2=R5=OH,R1=R3=OCH3,R4=R6=H53联苄类3,4-dihydroxy-5,4-dimethoxybibenzyl：R1=R2=OH,R3=R5=OCH3,R4=R6=H53联苄类3-O-methylgigantolIV：R1=OH,R3=R4=R5=OCH3,R2=R6=H53联苄类dendrophenolIV：R2=R4=R5=OH,R1=R3=OCH3.R6=H53联苄类gigantolIV：R1=R5=OH,R3=R4=OCH3,R2=R6=H53图1.1 铁皮石斛中芪类化合物母核1.3.7菲类和联苄类化合物李榕生等56从铁皮石斛乙醇提取物中得到6个化合物：2,3,4,7-四甲氧基菲、1,5-二羧基-1,2,3,4-四甲氧基菲、2,5-二羟基-3,4-二甲氧基菲、2,7-二羧基-3,4,8-三甲氧基菲、2,5-二羧基-3,4-二甲氧基菲、3,5-二羧基-2,4-二甲氧基菲。李燕等41分离得到denbinobin、2,4,7-三羟基-9,10-二氢菲。管惠娟和Li等48,53,57,58发现4,5-二羟基-3,3-二甲氧基联苄，铁皮石斛素A、C、D、E、F、G、J、K、H、L、B、M、N、O、I、P、Q、R，4,4-二羟基-3,5-二甲氧基联苄，3,4-二羟基-5,4-二甲氧基联苄，3-羟基-3,4,5-三甲氧基联苄，4,4-二羟基-3,3,5-三甲氧基联苄，3,4-二羟基-5-甲氧基联苄，3,4-二羟基-3,5-二甲氧基联苄，二氢白黎芦醇和dendromoniliside E等27个联苄类化合物。1.4石斛的药理作用1.4.1增强机体免疫作用铁皮石斛颗粒（TPSH）可促进荷瘤动物巨噬细胞的吞噬功能，增强T淋巴细胞的增殖和分化及NK细胞的活性，并能明显提高荷瘤动物的血清溶血素值，提示TPSH无论是对非特异性免疫功能，或是特异性细胞免疫以及体液免疫功能，均有一定的提高作用49。铁皮石斛多糖对S180实体瘤均有一定的抑制作用，其抑瘤率为9.7%26.8%，并且铁皮石斛多糖对S180肉瘤小鼠T淋巴细胞转化功能、NK活性、巨噬细胞吞噬功能及溶血素值均有明显提高作用59。杨明晶等60选择低、中、高剂量的铁皮枫斗西洋参胶囊（58、117、350mg/kg），调节小鼠的免疫功能，发现每天补充中、高剂量的铁皮枫斗西洋参，30d后小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性明显增强。1.4.2抗氧化作用何铁光等26研究证明，铁皮石斛原球茎多糖组分DCPP1a-1能有效地清除超氧阴离子和OH，并能抑制小鼠肝匀浆及肝线粒体丙二醛（MDA）的生成和肝线粒体肿胀。鲍素华等61研究发现不同相对分子质量的多糖，在不同抗氧化体系中，其抗氧化活性差异显著，DSP对OH清除作用强于其他多糖；DSP1对DPPH的清除率、抑制Fe2+-VC诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化能力、抑制H2O2诱导红细胞氧化溶血能力和总抗氧化能力最佳；DSP2抗氧化能力最弱。铁皮石斛多糖分子质量小于3.53104u或大于7.44104u时抑制DNA损伤的生物活性较高，且明显强于VC。汤小华等62研究发现鲜铁皮石斛（3g/kg）和铁皮枫斗（0.5、0.90、1.35g/kg）均能提高血清和肝中超氧化物歧化酶（SOD）、肝谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，鲜铁皮石斛（6g/kg）能提高血清SOD、肝GSH-Px；鲜铁皮石斛（3、6g/kg）和铁皮枫斗（0.45、0.90g/kg）均能降低血清和肝MDA；鲜铁皮石斛（9g/kg）能降低血清MDA；铁皮石斛和铁皮枫斗对急性酒精性肝损伤模型小鼠具有抗氧化作用。铁皮石斛水提物、大豆异黄酮提取物及二者合用对正常小鼠红细胞SOD活力的影响均无显著差异（P0.05）；但可显著提高小鼠肝组织中SOD活性和降低MDA含量，联合用药对小鼠肝脏SOD活性增效系数Q值为1.44，说明铁皮石斛水提物与大豆异黄酮提取物具有协同抗氧化作用63。1.4.3抗肿瘤作用马国祥等64分析石斛中的18个种，发现铁皮石斛含有鼓槌菲（chrysotoxene）和毛兰素（erianin），这两个菲类化合物具有对肝癌和艾氏腹水癌细胞抑制活性。李燕41进行抗肿瘤活性的初步筛选，发现联苄类化合物4,4-二羟基-3,5-二甲氧基联苄对人卵巢癌细胞株（A2780）有活性，4,4-二羟基-3,3,5-三甲氧基联苄对人胃癌细胞株（BGC-823）和人卵巢癌细胞株（A2780）有活性。铁皮枫斗多糖、菲类、联苄类化合物具有抗肿瘤活性及抗多药耐药性，能抑制多种人体肿瘤细胞株增殖。铁皮石斛多糖联合rIL-2，显著增强脐带血和肿瘤病人外周血LAK细胞体外杀伤作用，通过LAK/rIL-2免疫作用治疗恶性肿瘤。毛兰素(erianin)对小鼠肝癌抑瘤率为50.82%，对肿瘤细胞株K562生长的抑制作用，随着药物浓度的增加而增强。临床观察也发现65，铁皮枫斗晶、铁皮枫斗颗粒（胶囊）是放化疗肿瘤患者对症辅助治疗的有效药物，能显著减轻放疗副反应。多糖和芪类化合物的抗肿瘤活性，提示铁皮石斛不仅可以用于癌症对症治疗的辅助用药，亦可作为抗肿瘤药物研究开发的候选物。1.4.4抗疲劳作用石斛洋参冲剂能使异丙肾上腺素处理小鼠游泳时间延长、增加小鼠耐缺氧能力，提高甲亢型小鼠存活率。铁皮枫斗晶能维持运动小鼠肝糖原含量，明显降低运动后血清尿素氮和血乳酸含量，均表现明显的抗疲劳作用66。1.4.5降血糖作用吴昊姝等67对铁皮石斛浸膏的降血糖作用及其机制研究表明，铁皮石斛浸膏对正常小鼠血糖及血清胰岛素水平无明显影响，但可使链脲佐菌素性糖尿病大鼠的血糖值降低、血清胰岛素水平升高、胰高血糖素水平降低，还可通过增加大鼠胰岛素细胞，减少细胞，修复链脲霉素诱导的细胞损伤，进而升高血清胰岛素、降低胰高血糖素水平。铁皮石斛也可通过抑制肝糖原分解和促进肝糖原合成，减少血糖来源，增加血糖去路，影响肾上腺素性高血糖小鼠血糖和肝糖原水平。陈爱君等68发现铁皮石斛膏3g（生药）/kg剂量灌胃给药可降低四氧嘧啶所致糖尿病模型小鼠的血糖值，并明显改善该模型小鼠的糖耐量，减少其血糖曲线下面积。1.4.6生津作用铁皮石斛的生津作用，主要表现为促进腺体分泌和脏器运动27。对消化系统作用：最初研究表明，铁皮石斛和西洋参合用不仅能促进正常家兔的唾液分泌。还能拮抗阿托品对家兔唾液分泌的抑制作用。铁皮石斛单用能促进大鼠胃液分泌、小肠推进运动和小鼠排粪功能。其机制与抑制细胞膜上的Na+/K+ ATP泵有关69。临床应用也证实，铁皮石斛可以显著改善口腔气管插管患者口腔溃疡愈合率70。进一步证实了铁皮枫斗晶能养阴益胃生津，维护消化系统功能。对呼吸系统的作用：与前期铁皮石斛提取物结果相同，铁皮枫斗晶能显著促进小鼠气管酚红排泌和家鸽气管内墨汁运动速度，抑制氨水引起的小鼠咳嗽。显示明显的祛痰和镇咳作用71。1.4.7其他药理作用铁皮石斛提取物对易卒中型自发性高血压大鼠（SHR-sp）具有缓和持久的降压作用，并且其降压作用与用量有一定相关性72；对SHR-sp大鼠具有延长生存时间、提高生存率、预防中风的作用，并且铁皮石斛提取物与西药尼莫地平合用对SHR-sp大鼠能较好地延长生存时间、提高生存率、预防中风73。鹿伟等74对小鼠经口灌胃不同剂量铁皮石斛样品30d，与阴性对照组相比，铁皮石斛样品3个剂量组小鼠负重游泳时间均显著延长，血乳酸和肌酸激酶含量均显著降低，铁皮石斛在提高运动耐力的同时，能显著加快代谢产物的清除，同时通过调节机体免疫功能，促进疲劳的尽快恢复。黄琴等75研究得出铁皮石斛胚状体各剂量组（0.2、0.4、0.8g/kg）可以在人体跑步30min后提高血糖含量并降低全血乳酸含量，中、高剂量组可以降低运动后肝糖元及肌糖元的消耗，各剂量组均能明显降低血尿素氮的含量。铁皮石斛生境独特，对气候要求十分严格，自然成活率极低，野生资源濒临枯竭76。1987年国家将铁皮石斛列为重点保护野生珍稀药材品种，第1批中国珍稀濒危保护植物名录将铁皮石斛列入其中，濒危野生动植物种国际贸易公约也将其列为濒危和特别需要关注的药用植物加以保护77。近年来，石斛属植物资源极其紧缺，某些种已濒临灭绝。而铁皮石斛的市场需求持续旺盛，但其野生资源有限，加之铁皮石斛生境不断遭受破坏，导致铁皮石斛野生资源濒临灭绝，无法满足市场需求。因此，应设法提高铁皮石斛多糖提取率。基于此，本试验在单因素试验基础上，采用正交试验探讨铁皮石斛多糖的最佳提取工艺条件，对石斛粉碎程度、液料比、多糖提取温度和提取时间4个因素进行工艺优化，确定最优提取参数。2实验2.1材料和试剂、仪器2.1.1仪器电子天平：AL204-IC，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；低速台式离心机：800型，上海手术器械厂；循环水式真空泵：SHZ-D（），巩义市予华仪器有限责任公司；数显恒温水浴锅：JXL-2S-6A，江苏省金坛市金祥龙电子有限公司；中草药粉碎机：FW177型，天津市泰斯特仪器有限公司；研钵、研磨棒；旋转蒸发器：RE-2000A型，上海亚荣生化仪器厂；紫外可见分光光度计：722G型，上海精密科学仪器有限公司。烧杯；量筒；刻度试管；圆底烧瓶；回流管。2.1.2材料及试剂干燥的铁皮石斛颗粒；D-无水葡萄糖标准品：含量98%，批号为，上海金穗生物科技有限公司；蒽酮；硫酸；无水乙醇；水为蒸馏水。2.2试验方法采用硫酸-蒽酮比色法测定其多糖含量，在620nm处使用紫外-可见分光光度计测定吸收度； 2.2.1预处理与纯化过程精密称取铁皮石斛干燥粉末（过孔径为0.354mm筛）1.000g，置圆底烧瓶中。用70mL乙醇（95%）加热回流2次除去杂质，每次一小时。设置反应条件液（mL）料（g）比为65：1、提取时间为2h、提取2次，在90热水下回流提取。提取之后过滤，将滤液置250mL容量瓶中定容，得石斛多糖粗提液。分别精密量取1mL定容后的滤液置10mL离心管中，加入9mL体积分数为80%的乙醇，摇匀，冷藏1h，取出，以4000r/min离心15min，所得沉淀加体积分数为80%的乙醇洗涤2次，每次10mL，弃去上清液，沉淀用热蒸馏水溶解，转移至25mL容量瓶中，放冷后加水至刻度，摇匀，即得铁皮石斛多糖浸提液21。2.2.2样品制备及试剂配制标准品溶液的制备：精密称取葡萄糖标准品25mg置于250mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配置成0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。蒽酮-硫酸溶液的制备（现配现用）：精密称取蒽酮0.1g，加80%的硫酸溶液100mL使溶解，摇匀，放置于棕色瓶中，冷藏。2.2.3测定1）测定原理采用蒽酮-硫酸比色法测定其多糖含量，在620nm处使用紫外-可见分光光度计测定吸收度。2）测定方法标准曲线的绘制：分别精密吸取0.1mg/mL葡萄糖标准品溶液5ml、20ml、50ml、80ml置于100ml容量瓶中，各加蒸馏水至刻度，将溶液稀释为5、20、50、80g/mL。精密量取上述各浓度的溶液及葡萄糖标准液2.0mL于10mL具塞试管中，精密加入蒽酮硫酸溶液6.0mL，置水浴加热15min，取出，迅速冰浴冷却15min，室温放置5min左右，以蒸馏水代替标准溶液为空白对照，按照紫外-可见分光光度法，测定625nm处吸光度。以浓度（C）（g/mL）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标，进行回归计算，绘制标准曲线（如图2.1所示）。得回归方程y=0.0007x+0.0121，相关系数R=0.9945。表明葡萄糖浓度在5100g/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。图2.1 葡萄糖标准曲线样品测定：精密量取本实验制得的石斛多糖浸提液2mL于10mL具塞试管中，精密加入蒽酮硫酸溶液6.0mL，置水浴加热15min，取出，迅速冰浴冷却15min，室温放置5min左右，以加水试剂空白对照，按照紫外-可见分光光度法，测定625nm处吸光度。记录吸光度值，查标准曲线得知对应的葡萄糖含量。2.2.4铁皮石斛多糖抗氧化性测定羟基自由基的清除（Fenton78反应）大量研究表明，羟基自由基（OH）具有极强的氧化能力，它能导致生物体内DNA，蛋白质和脂质氧化损伤，对生物组织产生极强的危害作用。本试验通过Fenton法研究铁皮石斛茎多糖对羟基自由基（OH）的清除作用。用Fenton反应法产生羟基自由基（OH）。H2O2/Fe2+体系可通过Fenton反应产生经自由基，化学反应如下:H2O2+Fe2+OH+OH+Fe3+用OH氧化水杨酸产生有色物质，该产物在510nm处有强吸收峰，若体系中加入清除OH的物质，则会减少有色物质的生成，吸收度降低。吸光度越低，清除OH效果越好。测量过程：取2支试管并依次编号为1、2。两支试管各加入9mmol/L的FeSO4 1ml，9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液2.00ml，将1号试管加入铁皮石斛多糖样品溶液2.00ml，2号管加2.00ml蒸馏水作空白对照。最后加入8.8mmol/L的H2O2 2.00ml启动反应。以上试管放入水浴锅