《让质粒鲜活起来》PPT课件

让质粒鲜活起来,生物技术102班第二小组成员：华璐、钟依依、苗舒、庄思静、章辉辉,质粒的概念,质粒是一类亚细胞有机体，结构比病毒还要简单，既没有蛋白质外壳，也没有细胞外的生命周期，却能在宿主细胞中独立地增值，并随着宿主细胞的分裂而被遗传下去。,Plasmid,目录,CONTENTS,异同分析,质粒的基本性质,质粒分子的构型多样、大小不一,共价封闭环状DNA，即SC构型。,开环DNA，称作OC构型。,线形DNA，即L构型,1,2,3,除了酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒外，目前发现的质粒都是以DNA方式存在的。,2020/5/21,质粒的自主复制性和可扩增性,根据质粒复制与宿主菌相关程度不同，可将质粒分为严谨型质粒和松弛型质粒（常被选为基因工程载体）严谨型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，其复制与宿主菌密切相关。松弛型质粒通常是分子量较小，不具传递能力的质粒，它在宿主菌内通常可含10-200个拷贝，且不受宿主菌蛋白合成的影响。,2020/5/21,质粒的可转移性,质粒的可转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。根据是否携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，质粒可分为接合型质粒和非接合型质粒两类。,2020/5/21,质粒的不相容性,质粒的不相容性有时也称质粒的不亲和性，它是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一个宿主细胞系中稳定共存的现象，这样的两种质粒称为不亲和质粒。,2020/5/21,质粒研制与发展的三个阶段,2020/5/21,常用的几种质粒,pBR322质粒载体这是目前常规基因克隆实验中最普遍采用的载体，有万能质粒之称。pUC质粒载体它实际上是由pBR322质粒载体改造而来的一系列质粒载体的总称。它包括有pUC8、pUC9、pUC12、pUC13、pUC18等。,2020/5/21,Pvu2067,pBR322质粒载体结构图,2020/5/21,pUC18质粒载体结构图,2020/5/21,pUC系列质粒载体的优点,与pBR322质粒载体相比，pUC系列质粒载体具有许多优越性：（1）具有更小的分子量和更高拷贝数。（2）由于具有来自大肠杆菌lac操纵子lacZ的基因，它所编码的肽链可参与互补作用，可用于组织化学方法检测重组体。（3）具有多克隆位点MCS区段。,2020/5/21,质粒的提取,在提出的许多用于从细菌中提纯质粒DNA的方法中都含有以下3个步骤:（1）细菌培养物的生长。（2）细菌的收获和裂解（3）质粒DNA的纯化。,2020/5/21,提取的方法,质粒DNA的提取方法主要有：碱裂解法（此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析）煮沸法酚氯仿裂解法。,2020/5/21,碱裂解法,1.接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2mlLB培养基。2.37振荡培养过夜。3.取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。4.加0.lml溶液I(1葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0)充分混合。5.加入0.2ml溶液II(0.2mM/LNaOH，1SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。,2020/5/21,6.加入0.15m1预冷溶液III(5mol/LKAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。7.以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8.加入等体积的异戊醇，混匀后于0静置10min。9.再以10，000rpm离心20min，弃上清。10.用70乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。11.待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中,2020/5/21,相关试剂的作用,（一）溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0主要作用是：调节反应液pH，使大肠杆菌悬浮于反应液中，螯合Ca2+、Mg2+等二价金属离子。（二）溶液II，0.2NNaOH/1%SDS主要作用是：两者共同作用，使细胞溶解（其中NaOH为主，SDS为辅）。,2020/5/21,（三）溶液III，3M醋酸钾/2M醋酸主要作用是：使钾离子置换SDS中的钠离子而形成不溶性的PDS，同时高浓度的盐，使得沉淀更加完全。（四）异戊醇主要作用是：为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。（五）乙醇主要作用是：进一步沉淀质粒DNA，去除残留的盐。,2020/5/21,质粒提取,基因组提取,提取步骤基本上都属DNA的提取步骤，包括细胞裂解，DNA释放，纯化，最后沉淀溶解