多糖的研究方法及其现状

多糖的研究方法及其现状,活性多糖的研究 -正在形成中的热点,方积年 中国科学院上海药物研究所2004.11.,生命的四大物质：,蛋白质核酸脂类多糖,六十年代以后, 随着现代仪器分析方法的飞速发展,使人们能成功的分离纯化和鉴定生物体内微量活性物质, 从而对糖特别是多糖的认识产生了飞跃。,愈来愈多的研究发现, 人的生命过程几乎都与糖链有关: 如 细胞间通讯, 识别和相互作用 细胞的运动和粘附 病原与宿主细胞的作用 等等. 这是因为糖链携带着生物信息. 它在细胞表面的分子识别过程中起着决定性作用.,血型 -红血球表面糖链末端糖基的不同,恶性肿瘤细胞与正常细胞的不同 -糖链的不同,1995年Hirabayashi提出 “类似于基因密码, 可能也存在多糖密码”的论点.,多糖的研究己愈来愈受到人们的关注. 国内外正在形成热点生物细胞 特征: 繁殖(复制)凋亡 -平衡 平衡破坏: 细胞过度增生-组织表 面大体积堆积(肿瘤)-增生 细胞基因突变(癌)癌细胞源于正常细胞 找既抑制癌细胞又不伤正常细胞-困难,多糖是一种免疫调节剂 (激活机体免疫反应) 但也有少数多糖具直接杀死癌细胞作用 或两者俱存- 治疗机体免疫功能受到严重损伤的癌症和爱滋病,-治疗多种免疫缺损疾病和某些细菌,病毒引起的疾病,多糖作为药物的最大特点是毒副作用很小,-多糖还具有明显的抗病毒、抗感染、降血糖、降胆固醇、降血脂以及最近我们实验室发现的刺激神经细胞生长作用徐, 冯教授: 抗心肌缺血作用,但是 多糖的研究必竟起步较晚,-各方面尚须进行深入的研究-大量新的活性多糖有待于研究与开发-作用机制有待于完善,多糖的构效关系的研究是寻找高活性多糖及深入研究多糖作用机制的基础,最近 作用机理研究 -进展快,机体 免疫细胞 多糖 -分子水平 -激活 -释放出细胞间传导的信息Cytokine -再作用于免疫细胞 -体内协同作用 最终 抑制肿瘤生长,多糖在机体免疫反应中相当于抗原 -免疫细胞可识别多糖 -迅速被多糖诱导激活产生免疫反应多糖作用机理研究集中于:1.多糖与免疫细胞是否有分子水平接触?2.怎样接触? 免疫细胞表面是否存在识别 多糖的受体?3.免疫细胞激活后如何协同作用杀死癌细胞?,研究至今 有的已阐明 如: 发现 -Glucan与免疫细胞(单细胞,巨噬细胞, 中性粒细胞,自然杀伤细胞)-发生特异性结合-活 化信号传导途径-调节细胞因子释放 1997发现人体单细胞表面的受体 多糖对机体作用后 细胞因子(TNF-, IL-1,2)浓度 显著,正在深入研究中: -D-(13)-Glucan -抗肿瘤 水溶 水不溶 不同立体结构(单螺旋 三螺旋 无规线团 半柔顺链 聚集体) 不同构象-不同活性 -由于细胞表面受体蛋白具特定构象-只识别特殊构象多糖 杂多糖 糖蛋白 -D-(13)-Glucan -显著抗肿瘤,阐明 多糖-靶细胞上受体 -分子水平药物设计 -重要指导意义多糖 分子内及分子间 较强氢键作用 -不溶于水 -影响活性 大量实验表明 衍生化 -水溶性提高-活性提高 近代研究另一热点,多糖衍生化两种方法1.不溶性多糖 水解 醇解 酶解 如 碱不溶性多糖 (-Glucan 与甲壳素复合物)-甲壳素酶解去甲壳素-水溶 甲酸解 多糖-99%HCOOH降解-99%EtOH沉淀-溶解,透析-冻干-formalated derivatives Smith降解 pH3-5水溶液0.1M NaIO4 氧化-NaBH4 还原-部分酸水解-Polyalcohols,2. 半合成方法 衍生化基团取代 -多糖中羟基中H 原 子-改变氢键作用-成盐改善溶解性 羧甲基化 硫酸化 磷酸化 羧甲基化 (1) 多糖(0.15M NaOH, 95oC, 2h)残渣水洗至中性-悬浮于0.06%NaCl-醋酸调pH至4.5(50oC 6h)-悬浮液pH调至碱性-氯乙酸反应-羧甲基化多糖钠盐.,(2)多糖均匀分散异丙醇中-加粉状NaOH-搅拌-氯乙酸进行非均相反应-产物硫酸化 在质子惰性溶液(DMSO, DMF)中进行-加入一定比例氯磺酸吡啶盐-控制温度及时间-获得不同取代度的硫酸酯化多糖,可以上述两种方法结合 如: 分枝的 -(13)-Glucan 先去侧链, 再羧甲基化-获得线状羧甲基葡聚糖 (显著免疫及抗肿瘤活性) -美国专利报导 -己应用于灵芝 灰树花 巨大口蘑 水溶性好 抗癌活性高的衍生物,目前研究得较为深入：,高等真菌(主要是蘑菇类)产生的 -葡聚糖,某些植物产生的具抗补体作用的 果胶类多糖,影响构效关系研究:,1) 多糖的化学平面结构测定比较困难, 特别是含有几种糖残基的杂多糖, 至于决定多糖活性的高级结构(三维结构)测定更难.因为多糖是水溶性胶状物质不能结晶,这样限制了用通常X-衍射方法去测定立体结构.,2) 多糖的体内药物代谢动力学研究困难,3) 多糖在分子水平下与蛋白质,核酸等其他分子相互作用的认识还不清楚. 由于目前有关多糖的药理研究主要局限于观察多糖在体外或体内的生物效应, 要达到分子水平,细胞水平还需大量研究.,己有的实验证明影响多糖生物活性的主要因素： 分子量,分枝度,高级结构,溶解度,粘度等,多糖-大分子-分子内的糖苷键有较强的旋转性 -决定了多糖的二级结构,氢键,范德华力,色散力和疏水性等非共价作用 -决定了多糖的三级结构,蘑菇类产生具抗肿瘤作用的多糖:,分子量 10万至100万,分枝度为2:3至1:5,三股螺旋立体结构的-葡聚糖,香菇多糖,云芝糖肽,裂褶菌多糖 -正式在临床上应用,证明在提高机体免疫功能上特别是肿瘤辅助治疗中具有显著作用-受到临床医生的青睐,但是,人们期待更有效的活性多糖的问世,特别是具有抗炎作用,抗病毒作用,降血糖作用,刺激神经细胞作用的多糖问世,目前主要可从二方面着手:,一是继续从高等真菌(如灵芝,猪苓,猴头菇,冬虫夏草,姬松茸)中寻找活性多糖.,同时重点从动植物特别是从传统的中草药及海洋生物（如海藻）中寻找高效的活性多糖.,实验证明: 许多属去邪扶正的中药-发挥主要作用的大多是多糖成份,-从中草药及海洋生物中寻找有效的活性多糖-方向,最新报道藻类中主要存在的硫酸酯多糖可以抑制HIV-I表面糖蛋白gp120与免疫细胞表面CD4受体的结合抑制合胞体的形成特别适合制成一种外用型杀菌剂以防止Aids通过性交途径的感染具有成本较低，水溶性好，不产生机体不良,我们认为影响发现活性多糖的关键:,分离纯化方法及检测手段, 多糖是水溶性大分子物质,它的分离纯化方法不同于一般小分子物质,而且常用的检测手段又不灵敏,所以常会将微量高活性成份的多糖作为杂质而丢弃.,结构改造及结构修饰-结构改造或结构修饰可以提高或改变多糖的活性.,如 具有抗肿瘤作用但无抗爱滋病毒作用的香菇多糖,如分子中引入 硫酸基 后,则几乎不再具抗肿瘤作用,却具显著抗爱滋病毒作用.,同样结构修饰或改造也可以改变给药途径,如高等真菌产生的具提高兔疫功能的-葡聚糖,一般注射有效,口服无效.但如果连接有少量 肽 成为多糖肽,或连接一些其他糖残基成为杂多糖,则口服有效.,这是制作真菌来源的保健品中值得注意的问题.却被许多人疏忽.譬如说市场上已有的香菇多糖保健品,实质上香菇多糖(Lentinan)口服是无效的,那么为什么这些保健品确实还是对人体有良好作用呢? 这是因为香菇提取物中不仅存在香菇多糖, 还存在其他对人体有效的活性物质,而真正起作用的就是这些活性物质,可以这么说保健品中香菇多糖含量越高,其效果越差.所以如果将香菇提取物命名为香菇多糖保健品是不恰当的.,目前对于多糖进行结构改造或修饰常用的方法:,过碘酸盐氧化 Smith降解 部分水解 衍生化 硫酸化,羧甲基化,羧乙基化,磷酸化,棕榈酰化,多糖的羧甲基化可以提高多糖的水溶性,一般水溶性提高其抗肿瘤活性也提高,多糖中引入硫酸基一般均可显著提高其抗爱滋病毒的活性,且其活性随主链中的氨基糖及分枝度的增加而增加,但随主链中去氧已糖及分枝度的增加而减少,从高等真菌中获得的-葡聚糖大多具明显的免疫活性,但它们在消化道内难以被肠道壁直接吸收而进入血液,所以必须通过注射才能发挥作用.如果进行结构修饰,使其能被消化道吸收,变注射为口服,则将大大简化给药途径.,从植物及海藻中获得的活性多糖一般是杂多糖,-它们大多口服也有效.,-植物及海藻来源的活性多糖可以作为保健品的优越之处,多糖是亲水性大分子,难以透过由脂质构成的细胞膜,所以口服有效常受到质疑.有人认为多糖主要与肠道细胞表面的相应受体分子起作用,或者通过胞饮内吞作用(pinocytosis)由消化道进入血液,然后刺激人体免疫细胞的成熟,分化和繁殖,诱导专一性细胞因子的产生与激活(所谓多糖是多细胞因子诱导剂),结果由这些免疫细胞去吞噬或杀死肿瘤细胞或阻断细菌,病毒的吸附或繁殖.,有人认为-葡聚糖是一种融合诱导剂,它能诱导免疫细胞与肿瘤细胞的融合,从而使肿瘤细胞消失.上述这些作用机制的理论有的虽被初步实验证实,有的却是推测,有待人们去进一步完善.,由此可见,至今活性多糖的研究尚属初级阶段.,多糖的应用可分为两个方面一类是利用多糖的独特理化性质，如易形成凝胶、高渗透压、高粘度和吸水性，制备医药材料、药物缓释剂、血浆代用品等另一类利用多糖的抗原性、抗肿瘤、降血糖、促进免疫功能等生物功能或活性制备疫苗或新药。至今从多糖中寻找具有抗爱滋病的新药已引起人们很大的兴趣。,美国学者M.Yalpani认为:,“至今多糖在生物技术领域仍是一个沉睡的巨人,有待于大家去唤醒.”,可以预言: 活性多糖的研究与开发将成为生命科学中的重要课题.,多糖多糖是由十个以上单糖通过糖苷键以共价键形式结合起来的聚糖（Polysaccharide或glycan）可用(C6H10O5)n表示，其中n10自然界很少存在n为10-30的多糖匀多糖只有一种类型的单糖组成的多糖杂多糖几种类型的单糖组成的多糖,表1记录了来自天然界的一些重要多糖。天然界存在的单糖种类很多,但组成多糖的单糖大致由表2 所示的一些单糖组成。,糖原（Glycogen） 硫酸软骨素（Chondroitin sulfate） 肝素（Heparin） 透明质酸（Hyaluronic acid） 壳聚糖（Chitin）,淀粉（Starch） 纤维素（Cellulose） 木聚糖（Xylan） 果胶（Pectin） 阿拉伯胶（Gum arabic） 卡胶（Mucilage）,琼脂（Agar） 藻酸（Alginic acid）卡拉胶（Carrageenin） 海带多糖（Laminaran）,葡聚糖（Dextran） 果聚糖（Levan） 黄源胶（Xanthan） 甘露聚糖（Mannan） 黑曲霉多糖（Nigeran） 细胞壁多糖（Cell wall polysaccharide）香菇多糖（Lentinan）,动物,陆生植物,海洋生物,微生物(包括高等真菌）,表1. 几种天然存在的多糖,表2. 构成多糖的通常的单糖,L-鼠李糖，L-岩藻糖，6-去氧-塔罗糖,去氧己糖,D-葡萄糖酸，D-半乳糖酸，D-甘露糖酸,糖醛酸,N-乙酰葡萄糖胺，N-乙酰半乳糖胺,己糖胺,D-葡萄糖，D-甘露糖，D-半乳糖，L-半乳糖，D-果糖,六碳糖,D-木糖，L-阿拉伯糖,五碳糖,单糖,类型,多糖研究与开发的关键 多糖均一组分 深入研究结构分析、构效关系多糖的纯度标准：不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量多糖纯品微观是不均一的，纯度只代表同一种多糖的相似链长的平均配布,通常符合下列标准即可肯定为均一多糖：1.在重复的纯化过程中其单糖的组成及摩尔比恒定或其它理化性质不变化。如分步沉淀（如30%,50%乙醇沉淀）得到的两组分其比旋度或单糖摩尔比不变。2.超离心后，具有相同沉降速率，即具有一个对称峰。3.高效凝胶层析（HPGPC）得到的一个对称峰 。,HPGPC目前检测多糖均一性最常用也是误差最小的一种方法多糖专用柱（不是通常的反相柱及氨基柱）检测仪（示差检测器或激光光散射仪）过去常用常压凝胶层析/分步收集/硫酸-苯酚法检测误差很大。,一.多糖的分离提取方法通过分离纯化不使原有的多糖性质改变（如结构改变、降解等）。存在于动植物细胞壁外胞外多糖存在于细胞壁内胞内多糖（大多数多糖）,超声波气流粉碎技术将动植物或真菌孢子的细胞壁破裂，大大提高了多糖的提取效率动植物的细胞大多由脂质包围，用机械粉碎后还必须脱脂（沙氏提取器，乙醇回流）脱脂后就可以进行提取,第一步动植物体的粉碎,A. 热水提取法：根据大多数多糖在热水中溶解度较大且稳定的性质进行提取这种方法提取多糖的破坏最小。即经过上述方法处理过的植物用沸水提取2-6小时。提取液如粘度不大，则可采用过滤法过滤去残渣，对于粘度大的提取液则必须采用离心法去残渣，即得到多糖提取液或上清液。有时可在热水中加入2-10%尿素，使多糖的构型改变（这种改变是可逆的），粘度降低，增加其在热水中的溶解度。,多糖的提取常用四种方法：,B. 稀碱水溶液提取法：酸性多糖或分子量较大的多糖在热水中溶解度不大，所以常用5-15% NaOH或Na2CO3水溶液提取。不过用稀碱溶液提取时，温度必须保持在10以下，否则多糖容易发生降解反应。通常在冷却的条件下（4），放置6-8小时，然后过滤或离心，滤液用稀盐酸调节pH至中性即得碱性多糖提取液。,我们实验室通常先用热水法提取，然后残渣再用稀碱溶液提取，这样可将大部分多种类型的多糖提取出来。用稀碱提取，其提取液中存在大量的无机盐，在下一步过程中必须设法除去。,C. 酶解法：粉碎的植物悬浮于水中调节至最适温度（通常是38-50）最适pH范围（通常是pH3.8-4.5）加入5-25%复合酶，反应4小时过滤去残渣滤液即为多糖提取液该法已在多糖保健品（如香菇多糖保健品）的制备中采用。但大多采用热水提取法及酶法相结合的办法，即先用热水提取，然后残渣再用酶法提取，这样多糖收率可提高许多。,D. 其它方法：对质子惰性的溶剂如二甲亚砜作溶剂提取多糖碱金属盐的有机溶剂如氯化锂-二甲氧基乙醇提取多糖酸性水溶液提取多糖以上这些方法现在大多数不采用了，理由是成本高、收率低,二多糖提取液中杂质的去除：,多糖提取液都含有许多杂质，主要是无机盐、单糖、寡糖、低分子量的非极性物质及高分子量的有机杂质（如蛋白质、木质素）透析法使用透析袋除去无机盐、单糖、寡糖和低分子量的非极性物质,透析袋是一种只限于小于某一排阻范围的分子通过的一种半透膜，如纤维素膜。不同的分子量排阻值构成不同型号的透析袋第一步是选择需要截留的分子量的透析袋类型透析袋需要经过预处理,通常将新的透析袋置于沸水中沸腾2-3小时（换水2次）以便去除透析袋中的杂质。透析袋可以反复使用，但用过的透析袋必须冲洗干净，然后浸在加有少量防腐剂（如苯甲酸）的水中于冰箱中保存（注意勿使其长霉及干燥！）,透析袋pH5-9时稳定提取液必须先调节pH至5-9后才可进行透析。透析袋较昂贵，对于要求不高的大量透析，可采用普通玻璃纸代替截流范围就比较不容易控制。采用连续透析仪进行透析操作简便透析袋原理是分子筛原理，有一定的分子量排阻范围由于多糖分子不是球形的，有的是线状的有时分子量较大的物质也可能透过半透膜,离子交换树脂法对于带有电荷的阴离子及阳离子（即无机盐）离子交换树脂的混合床去阴、阳离子大量的工业化去除离子,蛋白质除去通常采用方法：1. 酶法：蛋白酶将提取液中的蛋白质酶解。常用链霉蛋白酶(pronase)，其方法是在pH7-8时，加入链霉蛋白酶，37消化2-4天，然后反应物于沸水中加热5分钟以阻断反应。2. Sevag法：蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入加入氯仿体积1/5的正丁醇剧烈振摇20分钟离心，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白条件温和，缺点是效率不高，一般要重复5次左右去蛋白的最佳pH是4-5，常用于微生物来源的多糖,3. 三氟三氯乙烷法：等体积的三氟三氯乙烷加入到提取液中，在冷却的情况下搅拌10分钟，蛋白质成胶冻状，离心除去胶状蛋白质。上层水相再用上述溶剂处理2次，即得无蛋白质的多糖此法效率较高，但因溶剂沸点较低(b.p.56)，易挥发，且必须在低温条件下进行，不宜大量应用。,4. 三氯醋酸法：在冰浴中搅拌的情况下缓缓于提取液中加入15-30% 三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊。在低温下（4）放置4小时。离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖提取液由于三氯醋酸的酸性较强，往往会引起某些多糖的降解，所以操作必须在低温下进行，该法效率较高，常用于植物多糖的去蛋白。,脱色多糖提取液，常有较深的色泽（含有酚型化合物的杂质）作为保健品须脱色活性炭脱色法活性炭对多糖有较强的吸附作用，多糖损失很大弱碱性离子交换树脂去除多糖粗品中游离的色素对酸性多糖的吸附力强，故不宜使用。,过氧化氢脱色法将0.3-0.8%粗多糖水溶液用浓氨水调PH至8搅拌，50 加入过氧化氢（比例为10-30%ml/g）在50 下保持2小时醋酸调节至PH7.0减压浓缩3倍量乙醇沉淀，即得脱色的多糖。该法在多糖粗品的脱色中常用。但必须严格控制脱色条件，如温度、时间、PH等。尽管如此，该法也会引起一定多糖的降解损失。,最近我们实验室发明一种新的多糖脱色方法十六烷基三甲基溴化铵正己醇异辛烷反胶束溶液在一定盐浓度下，对多糖粗品进行脱色。该法具有方便、快速，多糖回收率高等优点。这种新方法已申报专利（申请号01105320.8）。 多糖提取液中杂质的去除，有时也可不采用上述方法，而直接用几次反复柱层析的方法（详见纯化部分）。,三多糖的纯化纯化是将分离所得的混合多糖纯化为各种单一的多糖。实质上，分离与纯化是很难明显区别开来的有时在分离过程已在纯化了譬如说先用中性热水提取，再用碱性水提取，就将中性水溶多糖及酸性水溶多糖按溶解度不同分离开来了反过来有的在纯化过程中进一步得到分离譬如说在柱层析过程中进一步将杂质分离,（一）、分步沉淀法：根据不同的多糖在低级醇或酮（通常是乙醇或丙酮）中具有不同溶解度而进行分离。分子量大的多糖较分子量小的多糖在乙醇（或丙酮）中的溶解度小逐步加大乙醇（或丙酮）的浓度可将不同分子量的多糖分别沉淀出来溶液中在搅拌下缓缓加入98%以上的乙醇，使乙醇的最终浓度为25%，加毕静置1h ，然后离心，得到上清液和沉淀，该沉淀即为分子量最大的多糖。,上清液继续在搅拌下缓缓加入乙醇，使乙醇浓度达到35%，静置1h，再离心，得到第二次沉淀，这时沉淀的多糖的分子量小于第一次沉淀。上清液继续加乙醇至浓度为50%及70%，再离心，即得第三、四次沉淀。第四次沉淀的多糖其分子量最小。分步沉淀的关键是尽量避免共沉淀发生，具体而言就是多糖混合物的浓度不能太高，乙醇加入速度不能太快，溶液pH呈中性。,应该说多糖浓度越小，共沉淀作用也小，则分离效果好。浓度太稀，会使多糖的回收率降低，且乙醇用量大。通常将多糖混合物的浓度控制在0.25-3%。分步沉淀在多糖纯化中常常首先使用，特别是分离分子量差别较大的两种多糖，它比柱层析方法简便多了。,（二）、 盐析法：根据分子量不同的多糖在一定浓度的盐溶液中具有不同溶解度的性质分离各种多糖。在多糖中加入中性盐如NaCl、KCl、(NH4)2SO4等至一定浓度，溶解度最小的多糖便沉淀析出,然后上清液继续加盐至更高浓度，则另一多糖又沉淀析出实质上它的原理与操作与分步沉淀相仿。盐析法在蛋白质纯化上用的很多。早期云芝多糖（PSK）的纯化就是应用该法。,盐析法的优点是成本较低，但分辨率不高，易产生共沉淀。影响盐析法分辨率的关键也是多糖的浓度。多糖溶液的浓度越小，则纯化效果越好。次要因素是溶液的pH及盐析温度。为了获得满意的实验重复性，溶液的浓度、pH及温度均必须严格控制。由于各种多糖性质不同，所以为了获得较好的分离效果，各种条件必须反复试验。,盐析剂很多，中性无机盐均可作为盐析剂，但在多糖中以硫酸铵用得最多。盐析法获得的多糖沉淀中含有很多盐类，必须经过透析去盐后方能进行下一步的纯化过程。,（三）、金属络合法：根据不同多糖能与各种铜、钡、钙和铅离子形成络合物而沉淀的性质进行多糖的纯化。常用的络合剂有氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等络合物沉淀水洗涤酸分解,最常用的是铜盐络合法及氢氧化钡络合法铜盐络合法：CuCl2、CuSO4、Cu(Ac)2溶液、Feling试剂,Feling试剂不能过量，否则产生的沉淀会重新溶解。得到沉淀后用水洗涤，然后用5% HCl(V/V)的乙醇液分解此络合物，用乙醇洗去CuCl2，得多糖。氢氧化钡络合法饱和Ba(OH)2溶液当Ba(OH)2浓度小于0.03mol/L时葡甘露聚糖和半甘露聚糖可全部沉淀，但阿拉伯聚糖和半乳聚糖不沉淀。沉淀用醋酸(2 mol/L)分解，上清液加乙醇沉淀即得游离多糖。,（四）有机盐沉淀法：2000年美国专利(US75920000111)报导从植物与微生物中提取粘多糖或蛋白多糖的新方法：溶液中加入有机酸单宁，与多糖形成有机盐复合物而沉淀。离心得沉淀，沉淀用有机溶剂或其它物质使单宁除去目前这种方法已用于制备多糖药物、化妆品、保健品中。这种方法特别适合于从芦荟及葡聚糖中分离乙酰化甘露聚糖。,（五）、季胺盐沉淀法：长链季胺盐能与酸性多糖形成络合物，在低离子强度的水溶液中不溶解的特性，使其沉淀析出，然后增加溶液的离子强度到一定范围，络合物则逐渐离解，最终溶解。常用于分离酸性多糖及中性多糖。季胺盐有十六烷基三甲基胺盐的溴化物(CTAB)及其碱（CTABOH）和十六烷基氯化吡啶（CPC）。实验时除控制溶液的离子强度外,还必须控制溶液的pH值,溶液的pH应小于9，并无硼砂存在，否则中性多糖也能沉淀出来。季胺盐沉淀的效果极好，它能从很稀的溶液中(如0.01%的浓度)通过选择性沉淀将酸性多糖沉淀出来。1-10%(W/V)的CTAB或CPC水溶液，在搅拌的情况下滴加于0.1-1%(W/V)的多糖溶液中，酸性多糖即能从中性多糖中沉淀出来一般说，酸性强或分子量大的多糖首先沉淀出来，所以控制季胺盐的浓度，也能分离各种不同酸性的多糖。,络合物在不同离子强度的盐溶液中、酸溶液中及有机溶剂中溶解度不同，据此可将多糖游离出来。将络合物沉淀溶解于3-4mol/L的NaCl中，然后加入3-5倍的乙醇使多糖沉淀，而季胺盐则留在溶液中。或在3-4mol/L的NaCl溶液中加入碘化物或硫氰酸盐使季胺盐沉淀出来，而多糖留在溶液中。也可用正丁醇、戊醇或氯仿等有机溶剂萃取季胺盐，最终均经过透析、去盐、冷冻干燥得到多糖。季胺盐沉淀法是一种较经典的方法，至今在多糖的纯化中还在使用，如香菇多糖的纯化，日本就是用此方法。,（六）、柱层析方法：使用最多的方法，效果好，操作简单（1） 纤维素柱层析：乙醇液将柱内纤维素（载体）平衡多糖混合物全部沉淀于惰性的纤维素不同浓度乙醇水溶液（如80%、60%、40%、20%）洗脱不同多糖依次洗脱出来先洗脱的是分子量最小的多糖最终洗脱的是分子量最大的多糖,在洗脱过程中，由于各种多糖在柱上进行无数次的溶解和沉淀过程，最终将各种多糖分离开来。实质上与分步沉淀法相反分步溶解法其理论塔板数较高，流出液的纯度高缺点是流速慢，纯化周期长，特别是对于粘度较大的酸性多糖,装柱与通常装柱法不同32g硅藻土与500ml 0.2mol/L CaCl2溶液相混，在搅拌下逐步加入640ml 0.2mol/L K2HPO4溶液，得到均匀散布于硅藻土颗粒中的磷酸钙沉淀，然后将此悬浮液装柱，上样后用0-0.2mol/L不同离子强度的磷酸缓冲液（pH6.5）洗脱。这种柱的流速也不快，所以柱层析一般在冷房中进行，以防止样品发霉变质。,分离酸性多糖采用的载体为硅藻土与磷酸钙的混合物：,（2）阴离子交换柱层析：纯化中首先使用的方法柱层析中应用的最普遍的一种方法，特别是对于体积较大的多糖溶液，大多数首先采用阴离子交换柱层析。通过层析多糖溶液得到浓缩及初步纯化（有的多糖通过该步骤即可得到各种均一多糖组分）。至今应用最广泛的阴离子交换剂二甲氧基乙基纤维素(DEAEcellulose)DEAE葡聚糖(DEAESephadex)DEAE琼脂糖(DEAESepharose),DEAEcellulose应用得最广泛DEAEcellulose具有开放性的骨架，多糖能自由进入载体中并进行迅速扩散较大的表面积，虽然其离子交换容量仅为0.700.75mmol/g，但其对多糖的吸附量较离子交换树脂大许多纤维素上的离子交换基团较少，排列疏散且碱性弱，对大分子的吸附较弱，用一定离子浓度的盐就可将其洗脱下来,阴离子交换柱层析适合于分离各种酸性、中性多糖及粘多糖分离机理不是单一的离子交换，更重要的是吸附与解吸附不同结构的多糖在阴离子交换剂上的吸附力强弱是不同的应用于中性多糖与酸性多糖的分离，不同中性多糖的分离。一般在pH6时，酸性多糖能吸附于交换剂上，中性多糖不吸附，然后用pH相同离子强度不同的缓冲液将酸性多糖分别洗脱下来柱为碱性（即OH型）时中性多糖也能吸附,多糖在交换剂上的吸附力与多糖结构有关吸附力一般随多糖分子中酸性基团的增加而增加对于线状分子，分子量大的中性多糖较分子量小的易吸附对于直链多糖与支链多糖，则前者吸附力大于后者,100gDEAE纤维素可上样多糖0.5-1.5g洗脱方式通常是不同离子强度的缓冲液梯度式洗脱/阶梯式洗脱（又称分段洗脱）,中性多糖还能与硼砂形成络合物将DEAE纤维素处理成硼砂型，使多糖溶液通过，则多糖与硼砂络合吸附于柱上，然后用不同浓度的硼砂盐溶液进行洗脱首先流出来的是不与硼砂络合的多糖最后流出的是与硼砂络合力最强的多糖。,DEAE纤维素可反复使用一般新的或用过的DEAE-纤维素是如此处理的：将其悬浮于大体积的水中，让其自然沉降，倾倒法除去细颗粒，用0.5mol/LNaOH浸泡2小时，蒸馏水洗至pH8.0，再用0.5mol/LHCl浸泡1h，水洗至pH5.0，0.5mol/LNaOH浸泡1h，水洗至中性，即为OH型的DEAE-Cellulose,置于抽气瓶中抽去载体中的气泡，处理完毕置于水中备用。,阴离子交换剂还有DEAE交联葡聚糖主要商品型号有DEAESephadexA25（多用于mw3万的多糖）DEAESephadexA50以及DEAE琼脂糖主要型号有DEAESepharoseCL6B（分离mw10万的多糖）优点：具有三度空间网状结构，不但具有离子交换作用，而且具有分子筛作用比纤维素具有更高电荷密度，故交换容量更大，分离效果更好,缺点：洗脱液pH或离子强度变化时，其体积变化较大，影响流速，价格比纤维素贵 DEAE交联葡聚糖及DEAE琼脂糖的处理（再生）与DEAE纤维素一样,这三种阴离子交换剂对于多糖的纯化，特别是粘多糖均存在流速过慢、柱床高度会随缓冲液浓度及pH的改变而改变，且稳定性差，使用寿命短等缺点。,20世纪90年代以后逐渐被化学稳定性好，流速快的Sepharose FF为骨架的离子交换剂的介质所代替主要型号：DEAE- Sepharose FF使用方法与DEAE纤维素相仿不能干燥保存，必须悬浮在水中保持,（3）凝胶柱层析：根据多糖分子的大小和形状的不同即按分子筛的原理进行分离的凝胶柱层析在多糖的分离纯化上应用得很普遍，通常在获得粗多糖后，先用阴离子交换柱层析、透析、干燥，溶解后再用凝胶柱层析交联葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel）三大类性能改良的新一代凝胶，如Sephacryl、Superdex、Superose,展开剂各种浓度的盐溶液及缓冲液（离子强度最好不低于0.2mol/L）凝胶柱层析其柱之装填好坏对分离效果及分离所需时间有很大影响一次装柱，沉降时间要长(至少46小时)，平衡流速要慢且稳定。上柱样品体积要小，柱要装得均匀，流速要慢，否则会出现“欲速而不达”的结果,（4）亲和层析：某些特定多糖具有和某些相对应的专一分子可逆结合的特性如一种凝集素（刀豆球蛋白）能专一的与分支多糖结合（亲和力）使它们结合后再将其解离，可以纯化多糖：一方作为配基（ligand）与不溶性载体结合使固定化，然后把含有欲分离的多糖溶液作流动相。这时溶液中只有能和配基具有亲和力的多糖分子被结合而吸附，其它多糖则流出柱外。然后再改变流动相的离子强度及pH，使配基与多糖解离，则被纯化的多糖就流出柱外。,优点效率高，操作简单，特别在分离含量较少的多糖，一次可以浓缩几百倍，甚至几千倍缺点找到一个理想的配基是很不容易的在多糖的纯化上用的不多,（七）其他纯化方法,1. 超离心法：根据不同分子量的多糖在强大的离心力场作用下具有不同沉降速度而将各种多糖进行分离。分为两种类型：差速离心法采用逐步增加离心速度，使不同大小的多糖分批分离出来。在较低速度时分离所得的是分子量较大的多糖，在较高速度下分离得到的是分子量较小的多糖。这种方法在多糖的分离上应用的不多。,密度梯度区带离心法主要根据是多糖在惰性梯度介质中进行离心，达到平衡,这时不同分子量的多糖（或其它溶质）分配到梯度中某一特定位置上，形成不同区带，然后将不同区带进行分离，即得到不同的多糖组分在多糖中应用的较多，特别是用这种方法检测多糖的纯度。常用的惰性介质有水、NaCl、CsCl等。平衡转速60000r.p.m左右（或离心力为12000g)。多糖密度梯度区带离心法在八十年代以前用的较多，且大多数用于半微量的制备。,2.超滤法：根据溶液中多糖分子的大小和形状不同，在一定压力下使其通过超滤膜,该超滤膜只允许一定分子量范围的多糖通过，实质上是一种分子筛原理。进行分离，理论上是可行的，但实际操作中，由于大多数超滤膜能吸附多糖，使其收率大大降低，特别是中空纤维超滤膜，对多糖吸附特别严重，必须避免使用。另外由于大多数多糖粘度大，所以超滤速度很慢，周期很长，多糖易变质，且大多数多糖的形状不是球形的，如果是线形的，则分子量大的多糖也能透过超滤膜。由于上述这些原因，超滤在多糖分离上也是应用得不多的。,3.制备性区域电泳法：在电场的作用下按分子量大小、形状及其所负电荷的不同而达到分离载体通常是玻璃粉。一般是这样操作的：用水将玻璃粉拌成浆状，装柱，用电泳缓冲液（如0.05mol/L硼砂，pH9.3）平衡3天，然后将多糖样品置于柱的上端， 接通电流，上端为正极（因电渗之故，多糖的电泳的总方向是向负极移动的)。电泳会产生大量热量，所以这种电泳柱必须有夹套冷却。,区域电泳的单位厘米的电压约为1.22.0V,，电流为3035mA，电泳时间约为512小时，电泳完毕，将玻璃粉载体从柱中推出，分割后分别用水（或稀碱）洗脱。这种方法分离效果较好，但时间较长，且分离量小，只适宜于实验室半微量制备。,综上所述多糖的分离纯化十分复杂，要得到均一的活性多糖组分并不容易，这就是阻碍多糖研究进展的原因之一。多糖的分离纯化方法很多，必须根据多糖的性质巧妙的选择正确的分离纯化方法，否则必然会造成所谓“多糖越纯，活性越小”的错误。例子：Yoshioka等曾从担子菌P.Ostreatus中分离得到一种抗肿瘤活性很强的-葡聚糖我们知道-葡聚糖一般不可能有很高活性。,用通常检测方法未发现其它多糖组分的存在，但经13C NMR分析发现该多糖中有-葡聚糖的信号，由此再采用独特的和葡聚糖的分离方法，获得微量的-葡聚糖的高活性部分，所以如果采用同样的多糖分离方法，则必然是越纯化，-葡聚糖含量越高，-葡聚糖含量越低，势必造成活性越小。香菇中含有六种以上的多糖成分，但真正有效的是其中一个水溶性差，含量只占万分之几的Lentinan，我们通常称为香菇