《蛋白质芯片技术》PPT课件

生命科学领域的新工具SELDI蛋白质芯片,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,20世纪90年代，随着全球基因组计划的推进，人类对生命科学的认识达到了新的未有的深度和高度。人类基因组工作草图公布后，标志着基因框架已经绘就，人类染色体总DNA有32亿碱基对，包含有3万个左右基因，远远少于原有约10万个基因的估计。但是，由于真核生物中基因结构的复杂性及现有基因识别技术发展的严重不足，所以适用范围仅限于原核生物或低等真核生物，此情况进一步表明人类对自身基因组的所有基因及其间隔序列还没有完全确定。,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,一、蛋白质组学研究的兴起及蛋白质芯片技术的问世,加之mRNA自身在贮存、转运、降解、翻译调空以及产物的翻译后加工，难以准确地反映基因功能的真正执行体的质与量。而功能性蛋白质是基因功能的执行体，能直接反应基因给予的信息，后基因时代便接踵而来。以蛋白质作为研究对象，对正常细胞及变异细胞功能进行分析，从而可以寻找疾病的特异性标志物；也可以利用寻找终末点的方法来对化学制剂和药物毒副作用进行评估。,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,一、蛋白质组学研究的兴起及蛋白质芯片技术的问世,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,EnablingProteomics,美国Ciphergen生物公司生产的SELDI-TOFMS（surfaceenhancedlaserdesorprion/ionization-timeofflightmass）主要包括三个基本部分：特殊材料制成的固相载体，即蛋白芯片阵列，组成芯池的特殊材料是根据要捕获蛋白质的属性而设计的，概括起来可归纳为两大类型：a.化学型材料；b.生物化学型材料。,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,二、SELDI蛋白质芯片仪的组成及工作原理,蛋白质芯片解读仪（proteinchipreader），蛋白质芯片解读仪是安装有脉冲式紫外线/氮激光光源的解析离子化（laserdesorptionionization，LDI）时间-飞行质谱仪（TOFMS）。基质分子吸收激光能量，样品解吸附，基质样品之间发生电荷转移使样品分子电离，经解析/离子化过程而形成气化离子状态，它们进入TOF-MS区域飞行。根据蛋白质通过离子室的飞行速度，得出每个蛋白质的质量/电荷比（m/z），其公式为：E1/2mv2ZV；M/ZK*t2（其中Z为电荷数，V为电压，v为飞行速度，K为一常数）。,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,用蛋白质芯片仪测定DetectionUsingtheProteinChipSystem,用激光解吸电离发法将保留在芯片上的蛋白质洗脱下来Retainedproteinsare“eluted”fromtheProteinChipArraybyLaserDesorptionandIonization电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定它们的质量IonizedproteinsaredetectedandtheirmassaccuratelydeterminedbyTime-of-FlightMassSpectrometry,蛋白质芯片软件控制分析系统（Software）SELDITOF-MS控制分析软件，由Ciphergen公司研发，软件控制分析系统使整个操作过程变的自动化、简捷化、人性化。目前所用的软件系统为proteinchipsoftware3.11版本，它主要包括：a.数据库的建立；b.内部信息及外部信息的校准；c.数据处理与分析。二维凝胶电泳（2-DE）是经典的蛋白质分离技术，SELDI蛋白质芯片技术对样品的要求以及对样品的处理大大简化SELDI蛋白质芯片仪最适合分析多肽及蛋白质混合物，它是现今灵敏度最高的质谱仪，能够对极微量样品进行分析。,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,ProteinDiscoveryandCharacterizationProteinChipAdvantages蛋白质飞行质谱的技术优势,从未经提纯的生物或临床样品中直接捕获,检测和分析蛋白质,不需任何标记或加尾.超高的检测灵敏度(1-50fmole的蛋白质)从超小样品体积(0.5l)到大体积(400l)的灵活选用小型实验或高通量筛选的自由选择:每次可准备8,16,96,or192个样品快速获取实验结果超精确的蛋白质分子量,在识别特定蛋白质表达物，细胞株肽库的建立，完成肿瘤生物学标志物的筛选和鉴定，从蛋白质水平上对药物毒性和安全性的评价等方面均证实蛋白质芯片是一种高通量、高灵敏度、高特意性且微型化的蛋白质分析系统。,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,药物靶点的发现和证实疾病监测(药物疗效的追踪等)毒理学临床诊断药物动力学,免疫方法设计与筛选受体配体反应蛋白质-蛋白质相互作用DNA-蛋白质相互作用,纯化策略的设计与纯化过程的监测蛋白质身份检索蛋白质修饰分析(磷酸化,糖基化等)抗原决定位点分析,蛋白质指纹图谱分析,蛋白质的纯化与分析,分子识别,ProteinChipApplications蛋白质飞行质谱的应用,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,由于新的蛋白质芯片技术能快速方便地找出痕量存在的蛋白质，因此可广泛应用于基础医学研究。DiamordDL等将Epstein-Barr病毒基因导入B细胞内，利用SELDI蛋白质芯片技术检测B细胞所分泌微量球蛋白的变化，精确筛选靶细胞进行传代培养，达到预期试验目的。SELDI蛋白质芯片技术正如基因芯片、组织芯片等生物芯片为生物信息时代的发展注入了活力。,1.在基础医学中的应用,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,Ad是神经系统进行性退变而形成的一种疾病，它是痴呆性疾病中最常见的一种。AD突出的特点表现在大脑组织中出现退化斑块及神经纤维联系混乱。HuwDavies等人利用SELDI蛋白质芯片仪对患者脑脊液进行检测，发现了-淀粉样蛋白肽（Amyloidpeptide，A），可导致人脑产生神经系统退行性改变；该研究小组还论证了A的差异性变体A1-42对大脑神经细胞的毒性作用。,2.在临床医学中的应用：老年痴呆症（AD）,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,前列腺癌在西方国家发病率较高，美国前列腺癌的发病率占男性恶性肿瘤第一位。由于血清中PSA的低特异性，导致许多假阳性和假阴性的发生，说明PSA作为前列腺癌早期诊断及前列腺内皮细胞恶变初期的检测指标不甚令人满意，GLWrightJr等人运用SELDI蛋白质芯片技术不但快速、准确地检测到未被检测出的前列腺癌患者的PSA，而且在前列腺癌患者的血清中发现三种具有免疫球蛋白捆绑因子活性的蛋白质，对前列腺癌的早期诊断有重要意义。Adam运用同样的技术在前列腺癌患者的尿液中发现9个蛋白质与正常人及前列腺增生患者尿液中的蛋白质含量不同，其灵敏度可达83，特异性为97，阳性预测率值为96。,2.在临床医学中的应用：前列腺癌,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,膀胱肿瘤在欧美一些国家的发病率仅次于前列腺癌，在我国是泌尿生殖系中最常见的肿瘤。VlahouA等学者收集94份尿液样本，其中包括膀胱移行细胞肿瘤患者（transitionalcellcarcinomaofthebladder，TCC），正常人和泌尿系其它良性疾病。TCC病人组中发现5个新的特异性蛋白标志物和7个蛋白质簇（分子量范围在3.3133kd）。利用SEDLI蛋白质芯片技术，检测TCC蛋白标志物的灵敏度为87，特异性达66。,2.在临床医学中的应用：膀胱癌,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,乳腺癌是女性肿瘤死因的重要杀手之一。PaweletzCP等应用SEDLI蛋白质芯片技术对乳头吸取液进行蛋白质组学检查，在对12个乳腺癌患者及15个健康对照者的检查对比中，发现乳腺癌患者4,233kd和9,470kd分子量的蛋白质含量明显增高。LiJ等将乳腺癌患者进行临床分期：0期4人，期38人，期37人，期24人，并设立对照组41人，其中25人为乳腺其它良性病变，其余为健康者。他们抽取患者血清利用IMAC3镍螯合金属芯片，发现0期和期患者血清中有3种蛋白质含量明显不同于无瘤者和期、期患者，为早期诊断乳腺癌提供了可靠依据。,2.在临床医学中的应用：乳腺癌,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,目前寻找胰腺癌特异性肿瘤标志物尤显重要。ChristopheRosty等应用SELDI蛋白质芯片技术对抽取的胰液样本进行研究分析，发现胰腺肿瘤患者及其它胰腺疾病患者都存在一种特异性蛋白质，分子量为16,570D，该蛋白质在胰腺肿瘤患者中的检出率为67（10/15），在其它胰腺疾病患者中的检出率为14（1/7），经证实该蛋白质为肝-肠-胰相关蛋白（HIP/PAP-）。胰腺肿瘤患者组与对照组相比，HIP/PAP-在胰液中及血清中的水平都明显增高（P0.001）。他们进一步研究得出：胰液中HIP/PAP-水平升高尤为明显，当浓度20g/ml时，患胰腺癌的可能性较浓度20g/ml的高出21.9倍。,2.在临床医学中的应用：胰腺癌,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,手术治疗早期大肠癌的5年生存率可达99，效果良好，但由于各种原因的影响对高危人群的筛选及对大肠癌的早期诊断率只有37，所以对大肠癌的早期诊断尤显重要。Roboz等分析大肠癌患者（34例）与正常对照组（14例）之间的血清蛋白图谱的差异，其中大肠癌患者高表达8.9425.3kD蛋白质，而9.3kD的蛋白质呈低表达，正常对照组上述两种蛋白质的表达情况与患者组正好相反。实验结果表明8.9kD和9.3kD蛋白质可作为检测大肠癌的肿瘤标记物。,2.在临床医学中的应用：大肠癌,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，在欧美地区的发病率及死亡率明显高于亚非等国家。在我国，随着人民生活水平的不断提高，大肠癌的发病率呈逐年上升趋势，这已引起人们的广泛关注。目前临床上缺乏早期诊断大肠癌的特异性标记物，因此从血清中寻求特异性标记物，用于大肠癌的早期诊断成为了急需解决的问题。,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,我们应用SELDI蛋白质芯片技术，利用IMAC3-Cu芯片对146例确诊为大肠癌患者，62例正常人及32例大肠良性疾病患者的血清进行蛋白质对比分析，发现大肠癌患者血清中蛋白质在4476Da至15122Da间有十个蛋白质含量有差异，灵敏度和特异性分别为97.26与95.92。同时用血清中CEA做对照检测，灵敏度不高，特异性仅为37。下一步的实验中，我们将对检测出的特异性标记物蛋白，进行分离纯化，将对其进行蛋白质组学的深入研究，进一步明确其结构和大肠癌形成发展过程中的详细功能。,蛋白质芯片技术的出现及对临床医学发展的影响,SEDLI蛋白质芯片技术问世以来，为研究蛋白质的特征、属性、功能提供了快速、准确、高效的技术平台。目前，SEDLI蛋白质芯片技术广泛应用于医疗、工业制药、食品卫生、生物工程等广阔领域。这项技术结合对基因组知识的认知，必将为疾病的早期诊断