紫外可见分光光度法综述.ppt

紫外可见分光光度法,目录,紫外可见光谱学原理和应用仪器样品处理及测定方法二极管分光光度计的特性,1.基本原理,电磁波谱：无线电波、红外线、宇宙射线、x射线、紫外线、可见光波长范围：200-800nm波长和频率：E=h=c/越短，E越高,短波长的紫外光能量高，这种成份导致了皮肤晒黑。,紫外可见光谱的来源：辐射作用于物质，发生反射、散射、吸收、荧光、磷光、光化学反应。通常测量紫外可见光谱时我们希望只发生吸收。分子内电子跃迁导致谱带变宽，产生吸收光谱,适用含量范围:10-5%50%,2.定性分析：,鉴定谱图和结构同一性的认证颜色其他定性信息蛋白质的熔点测定酶活性,3.定量分析：,朗伯比尔定律：A=bc(为摩尔吸光系数)多组分的分析叠加性原理：一种混合物在任何波长下的吸光率等与混合物中各组分在该波长下的A之和。浓溶液的不适用性化学偏离与仪器偏离,几乎所有金属元素的定量分析,0.01mol/L时,粒子相互影响电荷分别改变.也改变.浓电解质中有类似效应.,化学:缔合,离解,溶剂化,PH变化等仪器:单色光不纯.峰值处测量可改善,该方法能分析复杂的混合物和图谱相似的简单混合物。用最小二乘法计算的偏差表明了标准光谱和样品光谱的拟合程度，同时也说明了分析结果的准确性。,简单联立方程式最小二乘法偏最小二乘法（PLS）,关键组分的回归法（PCR）,多重最小二乘法（MLS）,多组分分析方法,4.间接测量：,化学衍生法分光广度滴定酶动力学分析,1.仪器设计,分光光度计的组成产生一定光谱宽度的电磁辐射光源色散装置：从光源发射宽的电磁波中选择特定的波长样品区域检测器:测量辐射强度,传统的分光光度计适用于测量光谱中单点吸光度,二极管阵列分光光度计比较：样品和色散元件的相对位置次序相反，称为反向光路,按构型分,单光束设计：提供高的光通量，灵敏度高；但光源漂移产生较大误差双光束设计：矫正漂移。斩光器以一定速度旋转，使空白和样品的交替测量每秒进行数次。缺点，降低了光的能量和灵敏度分光束设计：分裂器将光分成两束，同时穿过参比和空白，到达两个分开但一样的检测器，可同时测定样品和空白双波长设计：同时测定两个波长，如样品中两个同时发生的反应,2.主要仪器参数（可能影响吸光度测量值准确度及精确度的一些仪器参数）,光谱分辨率波长准确度及精确度线性动态范围漂移,SBW/NBW0.1,影响测光准确度和精确度的因素：杂散光和噪声,杂散光：检测到选定波长带宽以外的任何波长光。T=(I+Is)/(I0+Is)噪声光子噪声：在测量低浓度低吸光率样品时，影响精确测量两束高强度的光之间的微小差别。电子噪声：是固有的，与测定的光强度无关。在高吸光度样品的信号很小时影响大,液体样品固体样品弱吸收强吸收干扰光化学问题,动力学光谱法固相光谱法多元校正多组分测定,导数光谱法,一阶导数：,如果控制I0不变，则,而,结论：A信号也正比于c，在原拐点处灵敏度最大高阶导数光谱同样适用,导数光谱的特点：,随着导数阶数的增加，峰越来越尖锐，灵敏度提高,信噪比随导数的阶数增加而降低,原谱,一阶导数,二阶导数,二极管阵列分光光度计的特点,二极管阵列光谱学的优点二极管阵列光谱学的缺点,快速采集，多波长同时测定，灵敏度高，有统计学意义，很高的稳定性和可靠性，敞开式的样品室,分辨率较低，散射光严重，样品会分解,参考文献：Tonyowen著,现代紫外可见光谱学基础，1997，12-5965-5123E张剑荣，戚苓,方惠群编，仪器分析试验，科学出版社，1999曾永昌，向立人，周在德编，仪器分析，四川大学出版社，1992G.W.尤因著，