聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链，再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求。不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示：表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围丙稀酰胺%(w/v)a 有效分离范围（bp） 二甲苯青FFb 溴酚蓝b3.5 10002000 460 1005.0 80500 260 658.0 60400 160 4512.0 40200 70 2015.0 25150 60 1520.0 6100 45 12a N,N-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30b 给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）。聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：（1）分辨力强，长度仅仅相差.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶：多达10g的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm1mm）而不致显著影响分辨力；(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚胎微注射）。常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶：（1） 用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶 （2） 用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳【原理】非变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化小分子双链DNA片段（1 000bp），多数双链DNA在此胶中的迁移率大略与其大小的对数值成反比，但迁移率也受碱基组成和序列的影响，同等大小的DNA分子可能由于空间结构的不同而使迁移率相差10，故不能用它来确定双链DNA的大小。【试剂及配置】1. 30丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N，N-甲叉双丙烯酰胺1g，加水到100ml，加热至37溶解，室温避光保存，存贮期间溶液pH值应7.0。2. 5TBE缓冲液（pH8.3）:54 Tris碱，27.5硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水至1L。3. 10过硫酸铵（AP）：AP 1g加水定容到10ml，4下可存贮数周。4. TEMED（N,N,NN-四甲基乙二胺）。5. DNA分子量标准。6. 6凝胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF,30甘油溶于水中。7. 溴化乙锭（EB）1mg/ml或银盐染色法所需试剂。【操作步骤】1.用洗涤剂浸泡玻璃板，填条和样品梳，必要时用KOH/甲醇清洗（100ml甲醇加5gKOH配置），水洗后再用乙醇淋洗。每块玻璃板的一面都用聚硅氧烷溶液处理，以防凝胶与玻片贴紧并减少卸胶时凝胶破裂的可能性。2.装好灌胶用的玻璃片及垫条，用琼脂糖封住底、左、右三边。（进口BioRad垂直板电泳设备可不用封胶）3.依所分离DNA的大小来确定合适的凝胶浓度，如表所示 表2 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积试剂（ml）制备不同浓度（）凝胶所用试剂的体积3.5 5.0 8.0 12.0 20.030丙稀酰胺 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6ddH2O 67.7 62.7 52.7 39.3 12.75TBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.010过硫酸铵 0.7 0.7 0.7 0.7 0.74.每100ml胶液中加入35lTEMED，迅速混匀，用注射器注入胶床，插入样品梳，应密切注意胶内不要有气泡，检查有无凝胶渗漏。5.室温下聚合约30min，聚合完全时可见梳齿下二条折光线，小心拔出样品梳。6.在电泳槽中加入1TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔，并用缓冲液冲洗样品孔。7.于DNA样品加1/5体积6凝胶上样缓冲液混合，小心注入样品孔中（加样量为35l）。8.接上电极，以5V/cm（18V/cm）的电压进行电泳。9.参照染料迁移至所需位置时，切断电源，取出凝胶。按下列方法之一进行染色或显影，检测DNA的位置：（1）溴化乙锭染色法：由于PAG能抑制EB的荧光量，故用该法时，DNA量需大于10ng。将凝胶和玻璃板一起放入含0.5g/mlEB的1TBE缓冲液中，3045min后取出，水洗，紫外检测仪观察并照相。（2）银盐染色法： 10乙醇固定3min； 双蒸水洗1min； 2%HNO3洗3min； 双蒸水洗1min； 0.18AgNO3轻摇20min； 双蒸水洗1min； 3%Na2CO3显影30min（临用前配置，每100ml加入10l甲醛）。【问题与讨论】l 如何判断丙烯酰胺是否已聚合？丙烯酰胺聚合后梳子下方可以看见折光率不同的纹线。l “微笑”DNA是怎样造成的？ 凝胶太厚导致电泳时产生的热量很大，DNA条带出现微笑样弯曲 电泳时电压太高，凝胶中部产热不同而致DNA条带弯曲l 为什么有时候DNA条带成波浪形弯曲或严重扭曲？ 在拔出梳子后没有立即彻底冲洗加样孔，梳子残留的少量丙烯酰胺溶液在加样孔中聚合产生不规则的表面，引起DNA条带变形。 在电泳槽和凝胶中使用的不是同一批次的电泳缓冲液，离子强度或PH值的微小差异会形成缓冲液前沿，使DNA片断的迁移发生严重扭曲l 在银染中背景太深是如何造成的？甲醛加的太多或是Na2CO3配置的时间过久已发生了变化。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳【原理】变性聚丙烯酰胺凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂（尿素或甲酰胺）存在的情况下聚合而成的，用于分离和纯化单链DNA（RNA）片段，核酸的迁移率和碱基的组成及序列无关，常用于：测定双链DNA的长度；回收寡核苷酸。此方法迅速、简单、分辩率高，虽然产量较低（50所加样品），但也足以满足大部分工作的需要。多用于分离同位素标记的探针、分析SI核酸酶的产物和DNA测序等。【试剂及配制】：1. 5TBE缓冲液（pH8.3）:54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0),加水至1L。2. 42丙稀酰胺：丙稀酰胺40g，N,N-甲叉双丙稀酰胺2g，加ddH2O至100ml，加热至37溶解，室温避光保存。3. TEMED(N,N,NN-四甲基乙二胺)。4. 尿素。5. 10%过硫酸铵（AP）。6. 2甲酰胺上样缓冲液：5TBE 0.2ml去离子甲酰胺 0.9ml10%溴酚蓝 50l7. 7.0.3mol/L乙酸钠（pH7.5）。8. 8.TE缓冲液（10mmol/L TrisCl，1mmol/L EDTA，pH8.0）。【操作步骤】1. 制备PAG-尿素凝胶，按寡核苷酸长度权择适当浓度的凝胶（12%，15%，19%的尿素PAG分别对应被分离合适的寡核苷酸长度40100,2540，25mer）。按下列混合：称取25.2尿素（终浓度7mol/L）,取12ml 5TBE，42%丙烯酰胺（所需量），加水至60ml，加10%AP200lTEMED30l，混合并倒胶（避免气泡产生），在室温下聚合30min以上。2. 取出样品梳，安装电泳装置，在电泳槽中入1TBE，150