胶原蛋白与重组胶原蛋白的研究进展

第31卷第1期20L1年3月明胶科学与技术THESCIENCEANDTECHNOLOGYOFGELATINV0131NO1MAR20NE，E，J综述评论墨3胶原蛋白与重组胶原蛋白的研究进展陈光徐珍珍吴铭吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118摘要简要介绍了胶原蛋白的概况、类型、分布及其制备方法；阐述了胶原蛋白独特的理化特性和优良的生物相容性以及在化妆品、医药、饲料、工业等相关领域的应用；简述利用基因工程技术生产重组胶原蛋白的研究进展和发展前景。关键词胶原蛋白；重组胶原蛋白；类型；应用1胶原蛋白概述胶原蛋白COLLAGEN是一种白色的多肽一蛋白质，广泛地存在于动物骨、腱、软骨和皮肤及其它结缔组织中J，是细胞外基质ECM的主要成分，约占动物体胶原纤维固体物的85，占体内蛋白质总量的25一3O，具有支撑器官、保护机体的功能。作为一种纤维蛋白，胶原蛋白基本组成单位是原胶原分子。原胶原分子是由三股A螺旋结构的肽链缠绕形成的纤维状蛋白，长度约为300NM，直径约15NM，分子量为300KDA。胶原中含有大量的甘氨酸，约占总氨基酸残基的三分之一，其一级结构肽链为GLYXY重复序列，而X和Y主要是脯氨酸和羟脯氨酸，含量高达1530，这两种氨基酸为胶原所特有。酪氨酸及蛋氨酸等必需氨基酸含量低，而不含有色氨酸。因此，从营养角度上看，胶原属于不完全蛋白质。胶原蛋白含有少量的半乳糖和葡萄糖，具有一般蛋白质的化学性质，如发生氨基反应、羧基反应、胍基反应、甲硫基反应、羟基反应、显色反应、非酶磷酸化、交联反应、氧化一还原反应、与金属离子作用、与表面活性剂作用等；另外，还能与酸、碱反应发生胶解，具有自身特定的等电点。由于胶原蛋白分子表面有许多极性侧基，赋予其非同一般的吸水性能，可以结合自身质量10倍以上的水，而其本身不溶于水。目前发现的胶原蛋白家族大约有21个成员，根据其结构复杂的多样性可以划分为纤维胶原、微纤维胶原、非纤维胶原蛋白、六边网状胶原、锚定胶原蛋白、跨膜胶原蛋白、基膜胶原蛋白及其他有特殊作用的胶原UJ。其中胶原家族90都是纤维胶原，在组织中分布广泛。2胶原蛋白的生物学功能和应用21胶原蛋白在人体内的作用1保护皮肤，使皮肤具有适当的弹性。胶原蛋白占皮肤成分的70。皮肤有如一个大套子紧紧包住身体各处，表面积相当大。人体四肢活动时，皮肤中胶原蛋白发挥功能，使皮肤具有保护功能，又有适当弹性及坚硬度。2使骨骼坚硬且有弹性。胶原蛋白能使得钙质与骨细胞结合，不致流失。胶原蛋白在体内可以使骨骼与肌肉相联。骨与骨相连接部分，如膝盖、关节等软骨组织主要成分也是作者陈光1961一，女，汉族，吉林德惠人，教授，博士生导师，研究方向酶工程。联系人吴铭EMAILMANGOMAIL163TOM2明胶科学与技术胶原蛋白，使得运动时筋骨可保持柔软并具有弹性。此外，牙齿的坚硬而富有弹性也与胶原蛋白密不可分。3使肌肉细胞互相连接，并使其富有弹性和光泽。肌肉主要由肌纤蛋白及肌球蛋白构成，而胶原蛋白则可以使细胞与细胞进行粘合，同时也是身体构成材料之一。胶原蛋白分子所形成的立体骨架可以使身体保持良好姿势，并呈现适当柔软度。4胶原蛋白能使眼睛透光，眼角膜保持透明。5保护及强化内脏功能。22胶原蛋白的基本生物学性能1止血性能血管内膜损伤后暴露出的内膜下组织主要是胶原，可激活局部凝血过程而生成由纤维蛋白多聚体构成的血凝块，与血小板一起组成牢固的血栓，控制出血。可见，天然的胶原聚集体本身就是很好的止血剂J。2低免疫原性虽然胶原是大分子物质，但结构重复性大，可溶性胶原的免疫性很低，不溶性胶原的免疫性更低，一般机体不对其产生慢性排斥反应。因此，由胶原制备的异体组织器械，如猪或牛的心包、心脏瓣膜，可以长期植入人体。3细胞相互作用性能胶原蛋白作为细胞生长的依附和支架物，能诱导上皮细胞等增殖、分化和移行。在胚胎发育以及成年人的伤口愈合与组织改型期间，胶原蛋白和细胞的相互作用是细胞活动的一个必不可少的特征，胶原蛋白对上皮的形成起促进作用，甚至起诱导作用。4生物相容性胶原蛋白是细胞外基质的骨架，其特有的三螺旋结构，使其不论作为形成新组织的骨架被吸收，还是被宿主同化，都表现出良好的生物相容性。5生物可降解性胶原蛋白只有在胶原酶的作用下才能造成肽链断裂，破坏螺旋结构而被水解。这些水解片段在体温条件下能够自行变性，进一步被其他酶降解为寡肽或氨基酸，最后被机体利用或排出。因此，胶原的这种可控生物降解性，对于生物医学材料来说，是非常难能可贵的，可以制作人造器官进行移植。3胶原蛋白的生产31传统提取法生产胶原蛋白传统的制备方法是目前最主要的方法，即利用酸、碱水解法从动物结缔组织猪皮、牛皮、驴皮、鱼等中提取胶原蛋白，提取过程中会或多或少丧失其部分的生物活性，并且提取产品的成分非常复杂。除了酸、碱法外，还有酶解法提取胶原蛋白，该法具有较高的回收率、水解反应速度快、时间短等优点。常用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对猪皮进行胶原蛋白的提取，得到的酶解提取物在分子量、特性粘度、羟基脯氨酸含量等方面有着不同程度的区别，其应用领域也不尽相同。但是从动物组织提取的胶原蛋白为水不溶性蛋白，也不可能在不改变分子量的情况下重新溶解。因此，从动物提取的胶原蛋白可加工性很弱，直接限制了其许多潜在用途的开发。胶原蛋白在医学上应用己经有几十年的历史，其主要来源于动物结缔组织包括皮、骨和胎盘等。异种和异体来源的胶原蛋白存在以下儿方面问题1动物源疾病如瘟疫、禽流感等或人体传染病如病毒性肝炎和艾滋病等的传染危险；2胶原蛋白的异种或异体排斥反应，导致移植部位的无菌性炎症；3刚性很强，加工过程中易引起分子链断裂；4绝大多数为水不溶性，加工过程中所用溶剂很难脱除完全，导致细胞毒性；5由于排斥反应的存在，移植后人体对胶原蛋白的吸收率高，不能持续维持治疗效果，需要重复植入或注射。上述原因限制了异种和异体胶原在人体中的应用，并且该提取方法存在着成本高、污染重、来源受限制和提取量有限的致命缺点，从而限制了胶原蛋白的生产应用。第31卷第1期陈光等胶原蛋白与重组胶原蛋白的研究进展332化学合成法利用化学合成的胶原蛋白往往不具有生物活性结构，并且技术较为复杂、成本较高。有鉴于此，人们正着手用其他的方法获得无病毒隐患和排异反应，有着更强生物活性的胶原蛋白。目前只有在2006年，美国威斯康星州立大学的KOTCHFW和RAINESRTU采用全化学合成法合成了具有胶原蛋白特征序列的多肽，并成功的实现了胶原蛋白三螺旋结构的自组装。除了在医药方面的应用之外，他们还计划将该合成的胶原蛋白作为纳米材料来应用。33基因工程法为了能充分利用胶原蛋白的优良性能，避免动物来源的病毒的高风险，诸多学者利用基因工程技术，选用各种宿主细胞，如转基因鼠、昆虫、转基因蚕、转基因烟草、大肠杆菌、酵母等生产重组人胶原蛋白，其胶原蛋白产品具有安全性好、重现性好、质量稳定等优点，解决了传统提取方法存在的如疯牛病病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等性能。因此，对胶原蛋白进行改性就显得非常关键，其中利用基因工程技术生产类人胶原蛋白是近几年来该方面的研究热点。4胶原蛋白的应用41生物医学材料和临床应用胶原属于细胞外基质的结构蛋白，其复杂的结构对其分子大小、形状、化学反应性，以及独特的生物功能等具有决定性作用。胶原的性质特殊、资源丰富，近20年来在生物医学材料领域展现了很大的优势。例如，应用在手术缝线、止血纤维、人工皮肤、心脏瓣膜、角膜、神经修复、药物载体等很多方面。42美容和保健由于胶原及其水解物与人皮肤胶原的结构相似，相容性好，可以扩散到皮肤的深层，对人的皮肤有很好的营养作用，且胶原蛋白分子外侧存在大量的羧基和羟基，以及存在大量的甘氨酸等天然保湿因子，能提高组织细胞的贮水能力，使皮肤保湿；胶原蛋白溶液还有很强的抗辐射作用，因而广泛应用于化妆品行业，现如今市场中销售的面膜、眼霜、护肤霜等化妆品中很多都含有胶原蛋白。43在食品中的应用胶原蛋白在食品中有很多方面的应用。例如，在功能作用中可用于乳化剂、稳定剂、发泡剂、胶冻剂、澄清剂等；在改良作用中可用于肉制品、乳制品、饮料等方面；在模拟食品中用于人造海参、人造鱼翅、胶原蛋白丝、人工发菜等；还可以应用于可食包装膜和胶原肠衣等许多方面。44在工业中的应用随着胶原蛋白的应用价值不断地被开发，近年来在造纸工业、制革工业、日用化学工业等轻工业也有越来越多的应用。45在饲料中的应用饲用胶原蛋白粉是以制革的残次皮料、皮边角料等副产物为原料，用物理、化学或生物技术方法处理得到的蛋白质产品，营养价值较高，在动物生产中有一定的应用效果。5重组胶原蛋白特点和国内外研究进展51重组胶原蛋白类人胶原蛋白特点和优越性类人胶原蛋白的概念是基于人胶原蛋白的特征和主要功能序列重新优化设计的基因序列，表达的蛋白是设计序列翻译的具有人胶原蛋白特征的蛋白质，称为“类人胶原蛋白”。类人胶原蛋白HUMANLIKECOLLAGEN其生物学特性如下良好的生物学相容性、细胞黏附性、促新细胞形成和止血功能，而且其促进上皮细胞生长功能更强。与源于动物组织提取胶原蛋白的生物活性相比，它具有如下的优势1可加工性该重组类人胶原蛋白不仅保留了胶原蛋白的原有功效，而且由于它可形成三重复螺旋结构，因而赋予了其更新的功能，如在分子量及物化特性不变条件下的可加明胶科学与技术2011年3月工性。2无病毒隐患由于从动物组织中提取的胶原蛋白存在病毒隐患的致命缺点，而类人胶原蛋白则克服了此缺点。作为生物材料，它可广泛用于医疗行业中，从而拓宽了它可开发的用途。3水溶性该基因工程技术生产的类人胶原蛋白为水溶性蛋白，这一特性是该产品的另一竞争优势。4排异反应低由于该重组类人胶原蛋白是由人体胶原蛋白基因构建的，因此在进人人体后，其免疫排异反应与来自动物组织的胶原蛋白相比大大减少。52重组胶原蛋白的国内外研究进展伴随着基因工程、蛋白质工程技术等分子生物学研究的快速发展，科研人员开始把目光聚焦到利用基因工程技术制备类人胶原蛋白的研究，其中主要有重组胶原I、型的研发。早在1980年，UITTOJ等就从人皮肤细胞体外培养中得到了I型和型前胶原L1。1997年，芬兰OULU大学胶原蛋白研究中心，在研究人I、型胶原蛋白全序列的毕赤酵母表达中取得较大的成功U引。经过大量研究表明了胶原蛋白与脯氨酸羟化酶在宿主细胞的共表达是一个很好的策略。1998年，VAUGHNPR等在啤酒酵母中表达出了携带有羟基化片断的类人型胶原蛋白。NOKELAINENM等人使用两种杆状病毒转染的昆虫细胞生产类人特异性软骨胶原型，表达出具有稳定三维结构的蛋白L】，产量达到了50MGML。1999年，BRUINEC等人使用汉森酵母和毕赤酵母作为宿主，表达人I型胶原蛋白的A1肽链，并做了相关研究，发现使用胶原蛋白自身的信号肽能使汉森酵母表达并分泌重组蛋白，却不能使毕赤酵母分泌重组胶原蛋白L】。2000年，MYLLYHARJUJ等人使用甲基酵母PICHIAPASTORIS表达准人纤维胶原蛋白I、型L1引。2001年，荷兰的WERTENMWT等【19J利用重叠延伸PCR法获得了高度亲水特性重组明胶长度约300BP基因序列，并且改造后转入毕赤酵母中进行表达，生产重组明胶。2005年，美国FIBROGEN公司与日本的国家传染病研究中心合作研发长度仅为101个氨基酸的小分子量重组人源性明胶，利用毕赤酵母X一33进行表达，经过高拷贝的筛选后发酵生产了具有生物活性的人源性明胶，产量达到147GL，经纯化后替代动物来源的胶原蛋白应用于疫苗稳定剂。2006年，芬兰胶原蛋白研究中心妇继续利用毕赤酵母进行选择性的分泌表达没有C端肽的单链重组胶原蛋白片断，为以后的研究奠定了很好的理论意义。另外，还有报道称在转基因烟草及转基因蚕中表达出人源胶原蛋白J。由于哺乳动物细胞和昆虫细胞培养成本高，周期长，而且培养只能限于实验规模，目前要满足产业化、大批量需求几乎是不可能的。同年，日本广岛大学自然科学研究所吉里胜利教授在英国自然杂志网络版上发表其研究成果，构建表达载体并采用基因植入法把生产人胶原蛋白的基因植入蚕的细胞里，这样培育出的转基因蚕的绢丝腺能同时分泌绢丝蛋白和人胶原蛋白，但是人胶原蛋白表达量非常低，含量只有1左右J。在国内，西北大学的范代娣等采用PER扩增得到数段人胶原蛋自基因段，接着进行拼接重复，转化ECOLI，并通过高密度发酵培养生产人源性胶原白，所得重组胶原蛋白表达量高达294。2004年，东京农业科技大学的YAOJ等J对胶原蛋白细胞附着作用和自身交联螺旋相关序列作了研究，设计了长度为240个氨基酸的类胶原蛋白，并在大肠杆菌中得到了表达。可见重组类人胶原蛋白具有优于动物提取胶原蛋白的独特化学结构，因此具有许多优异性能，其应用领域十分广阔。大规模生产重组类人胶原蛋白的关键技术之一便是产品的第31卷第1期陈光等胶原蛋白与重组胶原蛋白的研究进展5分离纯化。科学先进的分离纯化技术不但保证产品的质量，而且直接决定产品的成本和经L3济效益。利用现代基因重组技术获得该蛋白在宿主细胞内的表达，已经成为研究热点。参考文献1蒋挺大，张春萍胶原蛋白第1版M14北京化学工业出版社，20012顾其胜，蒋丽霞胶原蛋白与临床医学M第四军医大学出版社，2003，PP343PROCKOPDJCOLLAGENSMOLECULARBIOLOGYDISEASEANDPOTENTIALSFORTHERAPYANREVBO一15CHE1JJ1995，644034344MENTINKCAALETA1GLUCOSEMEDIATEDCROSSLINKINGOFCOLLAGENINRATTENDONANDSKINLJJCLINICALCHEMICALACTA2002，32169765王镜岩，朱圣庚，徐长法。生物化学第三版M北京高等教育出版社，2002，PP215218166徐新宇胶原的提取、改性、交联及其应用J透析与人工器官2O04，15336397郭炜，李荣文，董燕医用胶原蛋白海绵在骨科中的应用J中国矫形外科杂志L72003，11148MORIMURAS，ETA1DEVELOPMENTOFANEFFECTIVEPROCESSFORUTILIZATIONOFEONAGENFROMLIVESTOCKANDFISHWASTEJJPROCESSBIOCHEMISTRY2002，371214031412189MAFIAS，ETA1ISOLATIONOFCOLLAGENFROMTHESKINSOFBALTICCODLJJFOODCHEMISTRY2003，8L225726210GIMENEZBETA1USEOFLACTICACIDFOREXTRACTIONOFFISHSKINGELATIN【JJ0DHYDRO19COLLOIDS2005，19694195011王川，李燕，马志英等几种酶法从猪皮中提取胶原蛋白的对比研究J食品科学2007，2812012042012KOTCHFWRAINESRTSELFASSEMBLYOFSYNTHETICCOLLAGENTRIPLEHELICESLJJPNAS2006，103930283033UITTOJ，ETA1COLLAGENBIOSYNTHESISBYHUMANSKINFIBROBLASTSISOLATIONANDFURTHERCHARAETERIZATIONOFTYPE工ANDTYPEPROCOLLAGENSSYNTHESIZEDINEULTUREJJBIOCHIMBIOPHYSACTA1980，6242545561FUKUDAK，ETA1FORMATIONOFRECOMBINANTTRIPLEHEFICALALIV2以IVCOLLAGENMOLECULARINCHOCELLS【JJBIOCHEMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMMUNICATIONS1997，231178182VUORELAA，ETA1ASSEMBLYOFHUMANPMLYL4一HYDROXYLASEANDTYPEIIICOLLAGENINTHEYEASTPICHIAPASTORISFORMATIONOFASTABLEENZYMETETRAMERREQUIRESCCEXPRESSIONWITHCOLLAGENANDASSEMBLYOFASTABLECOLLAGENREQUIRESCCEXPRESSIONWITHPROLYL4一HYDMXYLASEJJEMBOJOURNAL1997，162267026712VAUGHNPR，ETA1PRODUCTIONOFRECOMBINANTHYDORXYLEDHUMANTYPECOLLAGENFRAGMENTINSAEEHAMMYCESCEREVISIAELJJDNACELLBIO11998，176511518NOKELAINENM，ETA1EXPRESSIONANDCHARACTERIZATIONOFRECOMBINANTHUMANTYPEIICOLLAGENSWITHLOWANDHIGHCONTENTSOFHYDROXYLYSINEANDITSGLYEOSYLATEDFORMSLJJMATRIX1998，166329338BRUINEC，ETA1EXPRESSIONANDSECRETIONOFHUMANALIPROEOLLAGENFRAGMENTBYHANSENNAPOLYMORPHAASCOMPAREDTOPICHIALPASTORISJJENZYMEANDMICROBIA2NOLOGY2000，269640644MYLYHARJUJ，ETA1EXPRESSIONOFRECOMBINANTHUMANTYPEI11ICOLLAGENSINTHEYEASTPICHIAPASTORISLJJBIOCHEMSOCTRANS2000，284353357WEENMWT，ETA1SECRETEDPRODUCTIONOFACUSTOMDESIGNED，HIGHLYHYDROPHILICGELATININPICHIAPASTORISJJPROTEINENGI6明胶科学与技术20L1年3月NEERING2001LSEND，ETA1EXPRESSIONANDEHARAETERIZATIONOFALOWMOLECULARWEIGHTRECOMBINANTHUMAILGELATINDEVELOPMENTOFASUBSTITUTEFORANIMALDERIVEDGELATINWITHSUPERIORFEATURES【JJPROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION252005，40234635722PAKKANEN0，ETA1SELECTIVEEXPRESSIONOFNONSECRETEDTRIPEHELICALANDSECRETEDSINGLECHAINRECOMBINANTCOLLAGENFRAGMENTSIN26THEYEASTPICHIAPASRORISJJJOURNAZOFBIOTECHNOLOGY2006，T2322482562723OLSEND，ETA1RECOMBINANTCOLLAGENANDGELATINOFDRUGDELIVERYJADVANCEDDRUGDELIVERYREVIEWS2003，551547156724ADAEHIT，ETA1GENERATIONOFHYBRIDTRANSGENICSILKWORMSTHATEXPRESSBOMBYXMORIPMLYL。HYDROXYLASEASUBUNITSANDHUMANCOLLAGENSINPOSTERIORSILKGLADSPRODUCTIONOFCOCOOILSTHATEONTMNEDCOLLAGENS山HYDROXYLATEDPRALINERESIDUES【J