胃蛋白酶酶解提取鸡骨胶原蛋白工艺的研究

现代食品科技MODERNFOODSCIENCEANDTECHNOLOGY2008，VO124，NO12胃蛋白酶酶解提取鸡骨胶原蛋白工艺的研究王晨，吴晖，李晓凤，刘冬梅，赖富饶，仇宏伟1华南理工大学轻工与食品学院，广东广州5106402青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109摘要以干鸡骨粉为原料，研究了骨胶原的酶法提取工艺。实验结果表明原料需用I0MOLLHCI脱钙处理2D，用正己烷脱脂后，再利用胃蛋白酶进行酶解。最佳酶解工艺为加酶量150UG、PH值17、37条件下处理120MIN，然后在液固比61的情况下用水抽提5H。在上述条件下，骨胶原提取率可达184，其蛋白质含量为54。关键词骨胶原；提取；酶解中图分类号TS2012；文献标识码A；文章篇号16739078200812130004ENZYMATICEXTRACTION0FCOLLAGENFROMPOULTRYBONEBYPEPSINWANGCHEN，WUHUI1,LIXIAOFENG1,LIUDONGMEI，LAIFURAO1,QIUHONGWEI1COLLEGEOFLIGHTINDUSTRYFOODSCIENCES，SOUTHCHINAUNIVERSITYOFTECHNOLOGY,GUANGZHOU510640，CHINA2COLLEGEOFFOODSCIENCEENGINEERING，QINGDAOAGRICULTUREUNIVERSITY,QINGDAO266109，CHINAABSTRACTENZYMATICTREATMENTTOIMPROVETHEEXTRACTIONOFCOLLAGENFROMCHICKENBONEPOWDERWASEXPLOREDINTHISPAPERTHERAWMATERIALSWASDECALCIFIEDBY10MOLLHC1FOR2DAYS，DEFATTEDBYHEXANEANDTHENHYDROLYZEDBYPEPSINUNDERTHEFOLLOWINGOPTIMALCONDITIONSENZYMEDOSAGEOF150UG，REACTIONTIMEOF120MIN，PHVALUEOF17，ANDREACTIONTEMPERATUREOF37CFORTHEEXTRACTIONOFCOLLAGENFROMTHEENZYMATICHYDROLYZATE，THEBESTLIQUIDSOLIDRATIOANDEXTRACTIONTIMEWERE61AND5HRESPECTIVELYUNDERTHESECONDITIONS，THEEXTRACTIONRATEANDPROTEINCONTENTOFTHECOLLAGENFROMPOULTRYBONEWEREOF184AND54RESPECTIVELYKEYWORDSBONECOLLAGEN；EXTRACTION；ENZYMATICHYDROLYSIS骨胶原是存在于人体和动物体内的一种胶原蛋白，是人体关节软骨、骺软骨和骨小梁的主要成份，占骨骼有机物的80以上【L。如果把骨骼中的钙质比作建筑的水泥，则骨胶原就是钢筋【3J。骨胶原的应用相当的广泛，如在化妆品中添加适当的骨胶原可使皮肤保持光亮细嫩【4J；添加在肉制品中可改善产品的品质，并提高蛋白含量51等。我国禽肉年产量1350万吨，按比例计算大约有5万吨的禽骨下脚料，而在禽骨中约有16的物质为蛋白质。但由于受多种因素的限制，大量动物性食品加工的副产物均没有得到有效开发和利用【6】。如果这些下脚料能得到有效利用，将会为企业带来可观的经济效益。骨胶原蛋白的提取一直是各国学者的研究热点。目前胶原蛋白的提取主要有酸法、碱法和酶法三种。酸法和碱法不仅容易影响生物活性，而且提取率也相对较低。而酶法则可以弥补酸法和碱法的不足。目前，收稿日期20080530作者简介王晨1985，男，硕士研究生，方向食品质量与安全通讯作者仇宏伟，副教授，主要从事食品营养与安全方面的研究L300在从动物皮及其加工副产品提取胶原蛋白的研究中，酶法已经得到了广泛应用，但尚未见用酶法从禽骨中提取骨胶原蛋白的研究报道710。本文探讨了用酶解法从禽骨中提取骨胶原蛋白的工艺，以期为禽骨的深度开发利用提供参考。1材料与方法11材料与试剂鸡骨架、鸡腿骨正大食品；乙二胺四乙酸二钠EDTA、氢氧化钠、盐酸、乙醚、正己烷、乙酸、正丁醇、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、溴钾酚绿，均为分析纯，市售；胃蛋白酶酶活5000UG，青岛海汇生化制药有限公司1。12主要仪器设备SPS401F型电子天平，KS130B型振摇器，JJ2型组织捣碎机，SK一3型离心机，UDK142型半自动凯氏定氮仪，868型PH计，BCW205型旋转蒸发仪。1_3工艺流程原料挑选一清“L肉一烘干一粉碎成粉一脱钙一脱脂一酶解一抽提一浓缩一等电点沉淀一离心一烘干一测定现代食品科技MODERNFOODSCIENCEANDTECHNOLOGY2008，VO124，NO1214前处理适。分别用5倍质量的025MOLL和05MOLL的EDTA溶液、05MOLL及10MOLL的HCI溶液对鸡骨粉进行脱钙处理2D，再分别用乙醚、正丁醇、正己烷对脱钙后的样品进行浸泡脱脂，在加酶量150UGO每克鸡骨粉添加30MG的酶量、PH值18、37条件下酶解90MIN，然后在液固比71的情况下用水抽提4H，浓缩、干燥后称重并计算骨胶原提取率，确定不同前处理方式对骨胶原提取的影响。15酶解对原料进行脱脂脱钙后在不同PH值、温度下酶解处理一定时间，然后在液固比71的情况下用水抽提4H，浓缩、干燥后称重并计算骨胶原提取率，确定各酶解条件对骨胶原提取的影响。16抽提对原料进行脱脂脱钙处理，并在最佳条件下进行酶解，在一定液固比范围内抽提一定时间，浓缩、沉淀、干燥后称重并计算骨胶原提取率，确定各抽提条件对骨胶原提取的影响。17骨胶原提取率及蛋白质含量测定骨胶原提取率骨胶原质量鸡骨粉质量X100。蛋白含量测定根据凯氏定氮法的原理对最终的产品进行消化、蒸馏、滴定处理，测定其蛋白质含量。2结果与分析21前处理方式对骨胶原提取的影响由于动物骨骼中的钙质附着于骨胶原之上，若不进行脱钙处理则骨胶原很难溶出，所以在溶解蛋白质前要先除去附着在上面的钙质。有研究者采用盐酸或EDTA溶液处理骨料，可较为有效地除去无机盐及羟基磷灰石【L卜H】。此外，动物骨中还含有油脂和其他脂类杂质，若不去除会影响骨胶原的提取，因此在提取胶原蛋白之前必须对原料进行脱脂预处理【1引。表1不同脱钙剂对骨胶原蛋白提取的影响TABLE1EFFECTOFDECCIFYINGREAGENTONTHEEXTRACTIONOFBONECOLLAGEN由表1可以看出若不进行脱钙处理则骨胶原的提取率极低56，而利用EDTA脱钙与利用盐酸脱钙相比骨胶原提取率仅有有少量的增加08。由于EDTA的价格相对HC1较为昂贵，考虑到成本因素，使用5倍质量的10MOLL的HC1作为脱钙剂最为合表2不同脱脂剂对骨胶原蛋白提取的影响TABLE2EFFECTOFDEFATTINGREAGENTONTHEEXACFIONOFBONECOLLAGEN由表2可知未脱脂的对照样品因油脂太多，未能形成絮状的蛋白质沉淀，很难提取。在所选择的三种脱脂剂中乙醚的效果最好，但乙醚对食品的安全性影响较大，不适合用于食品的脱脂，而正己烷的脱脂效果和乙醚近似，易驱除，残留小。所以预处理时用正己烷作为脱脂剂最佳。22酶处理条件对提取骨胶原的影响221酶解PH的影响采用酶法提取胶原蛋白时，必须严格控制提取条件，如酶的种类、酶解时间及温度等。一般提取动物蛋白时，胃蛋白酶较为常用，其条件温和，易于控制。因此，本实验选用胃蛋白酶对处理后的原料进行酶解处理【9】，并研究了不同PH值、酶解温度、处理时间等因素对骨胶原提取的影响。曼旦芑窭PH图1酶解PH值对骨胶原蛋白提取的影响F1EFFECTOFPHVALUEOFENZYMATICHYDROSOFBONEPOWDEROFFTHEEXACFIONOFBONECOLLAGEN在前期实验中得知当PH值在1520时此蛋白酶的活性最大，为进一步确定最适PH值，考查PH值在1520时15、16、17、18、19、20对骨胶原提取的影响。从图1可知，在固定酶解温度及时间37，90RAIN的情况下，当PH值达到17时骨胶原的提取率达到最大值167，由此可确定最适PH值为17。继续提高PH值骨胶原的提取率也随之明显下降，这可能是由于PH值提高会导致酶活性的下降，降低了原料的水解度，从而影响骨胶原的提取。222酶解温度的影响图2表示在PH值为17及时间90MIN条件下，不同酶解温度35、36、37、38、39对骨胶原提取的影响。在3537范围内提高温度有利于骨胶原蛋白的提取，继续升高温度由于酶活性130L加50现代食品科技MODERNFOODSCIENCEANDTECHNOLOGY2008，VO124，NO12降低而导致提取率的下降，故取37为最佳酶解温120MIN。度，此时骨胶原的提取率最大，为172。芑L量5LTEMPERATURE图2酶解温度对骨胶原蛋白提取的影响FIG2EFFECTOFHYDROLYSISTEMPERATUREONTHEEXTRACTIONOFBONE22_3酶解时间的影响L董15旨10叠5L0LLL一306090L20150180TIMETMIN图3酶解时间对骨胶原蛋白提取的影响FIG3EFFECTOFREAEFIONTIMEONTHEEXTRACTIONOFBONECOHAGEN图3表示在PH值17，37条件下不同酶解时间30RAIN、60MIN、90MIN、120MIN、150MIN、L80MIN对骨胶原提取的影响。如图所示，当酶解时间为120MIN时骨胶原的提取率最大，为184。这是由于酶解时间过短时，胶原蛋白不能充分释放到提取液中，故提取率低。但如果酶作用时间过长，胶原蛋白会水解过度，产生过多的苦味小分子低聚肽和氨基酸，造成了骨胶原的流失。224酶解条件的优化单因素实验结果显示，不同的酶处理方式对骨胶原的提取率影响较大，因此选择PH值、处理温度、处理时间的3因素3水平的正交实验。正交结果和方差分析见表3和表4。由表3和表4可以得知酶解时间对骨胶原的提取率的影响较显著，而酶解温度和DH值对提取率的影响相对较小，因此三个因素对实验指标的影响的的主次顺序是时IN温度PH值，酶的作用时间对于酶处理法来说是主要影响因素。这可能是因为作用时问影响到了骨胶原的释放过程，时间的长短直接影响到骨胶原是否能从骨骼中充分的提取和是否被二次分解，而PH值和温度只是影响了胃蛋白酶的活性，对产品提取的影响相对较小。因此，由正交试验结果可知酶处理法提取骨胶原的最佳工艺是在PH值17，37C条件下处理L302表3正交试验直观分析表L93。TABLE3L933ORTHOGONALTESTDESIGN表4方差分析表TABLE4VARIANCEANALYSISOFL933OHOGONALTESTRESULTSX23抽提条件对骨胶原提取的影响201550L8RATIOOFLIQUIDTOSOLID图4水抽提液固比对骨胶原蛋白提取的影响FIG4EFFECTOFRATIOOFFIQUIDTOSOLIDONTHEEXTRACTIONOFBONECOHAGEN图4表示酶解后的产物在不同固液比31、41、51、61、71、81对骨胶原提取的影响。从图4知，骨胶原的提取率在液固比512_前缓慢上升，在5L61之问迅速提高，612_后就又接近平缓，可见，液固比为61时提取效果最好，骨胶原蛋白已完全溶于水中。图5表示在液固比为61的条件下，不同抽提时间1H、2H、3H、4H、5H、6H对骨胶原提取率的影响。当抽提5H后，曲线相对平缓，这是因为5H后蛋白现代食品科技MODERNFOODSCIENCEANDTECHNOLOGY2008，VO124，NO12质已经基本抽提完全，所以最佳的水抽提时问为5H，在此条件下提取率可达到184。一耋10叫0卜专_TIME|H图5水抽提时间对骨胶原蛋白提取的影响FIG5EFFECTOFEXTRACTIONTIMEONTHEEXTRACTIONRATEOFBONECOHAGEN在相同实验条件下，对比研究了以碱法和酸法【L6J提取鸡骨粉中骨胶原，结果表明，两种方法对骨胶原的提取率分别仅为745和351，远低于酶法提取的相应值。将在最佳提取工艺条件下获得的样品进行消化、蒸馏、滴定处理，测定样品中蛋白质的含量为54。3结论与讨论本文以禽产品加工下脚料鸡骨粉为主要原料，探讨了鸡骨胶原蛋白的酶法提取工艺，确定了最佳提取工艺条件为用5倍质量的10MOLLHC1进行脱钙处理2D，用正己烷脱脂后，在加酶量为150UG，PH值17，37C条件下用胃蛋白酶酶解120MIN，在液固比61条件下抽提5MIN。在上述条件下，骨胶原提取率可达到184，其中蛋白质含量为54，优于相同条件下酸法和减法提取的相应值。由于在酶解后的浓缩、沉淀、离心过程中有少量的灰分和碳水化合物等成分掺入，对产品的纯度产生了一定的影响。因此在实际生产中还应对产物进行进一步的分离纯化处理。骨胶原蛋白不仅在食品、化妆品等领域应用广泛，现有研究还表明其降解产物胶原蛋白肽尚具有降血压、抗衰老、增加骨密度等多种生理活性，因此，胶原蛋白的提取研究具有很高的实践和理论价值。从禽骨中提取具有高附加值的胶原蛋白，不仅实现了禽骨的高值利用，也充分发挥了其资源优势，为骨胶原蛋白的深入开发利用奠定了基础。参考文献1JOHANNAMYLLYHARJU,KARIKIVIRIKKOCOLLAGENSMODIFYINGENZYMESANDTHEIRMUTATIONSINHUMANSFILESANDWORMSJTRDSINGENETICS，2004，2033432】蒋挺大，张春萍胶原蛋白M】北京化学I,LK版社，2001，353正山四郎骨胶原一充满魅力的蛋白质J中外食品信息，1999，320214】周丽珍，陈玲，李琳等胶原蛋白的制备及用作生物医用材料的研究进展J中国医药工业杂志，2004，35427617635】李K，何小维，罗志刚胶原蛋白在食品工业中的应用J食品与药品，2006，8576066任俊莉，付丽红，邱化玉胶原蛋白应用及其发展前景J中国皮革，2004，33136387李二凤，何小维，罗志刚胶原蛋白的提取工艺研究J食品工艺，2006，3646688MASAHIROOGAWA,RAIPHJPOTTIER,MICHAELWMOODY,ETA1BIOCHEMICALPROPERTIESOFBONEANDSCALECOLLAGENSISOLATEDFROMTHESUBTROPICALFISHBLACKDRUMANDSHEEPSHEADSEABREAMJFOODCHEMISTRY,2004，884955019】SMORIMURA，HNAGATA,YUEMURA，ETA1DEVELOPMENTOF