第七章 定点诱变ppt课件

精选,1,第七章DNA定点诱变Site-directedmutagenesisofclonedDNA,精选,2,突变是研究基因结构与功能的最基本的手段经典的方法：分离自发突变体用物理、化学诱变剂处理活体诱变-整个生物体-目的基因上的突变极其有限体外诱变(invitromutagenesis)：对克隆化的DNA进行诱变处理可得到经典诱变所能得到的所有种类的突变,精选,3,突变方式:定点诱变随机诱变易错PCR(error-pronePCR)DNA重排(DNAshuffling)体外随机引发重组(random-priminginvitrorecombination)交错延伸(staggeredextensionprocess,StEP),精选,4,突变类型:单个碱基的置换简单的插入或缺失系统的缺失、插入或成串碱基的置换,精选,5,第一节随机诱变,体外随机诱变指随机地在克隆化DNA中引入碱基置换突变不需要有序列针对性的合理设计,引入突变的位置及其性质是随机的结果:在目的DNA片段中引入大量的序列多样性,得到的具体突变体可以是单点突变也可能是多点突变,精选,6,关键:选择合适的突变频率1.5-5bp/目的基因有益突变有害突变根据研究目的对突变体进行定向选择或筛选,找到感兴趣的突变颜色反应水解反应功能互补定向进化(directedevolution):一次突变难以得到满意的结果,必须反复多次诱变和循环筛选目的是获得满足人们需要的性能改良的蛋白质,精选,7,方法:错误掺入诱变盒式诱变(cassettemutagenesis)增变菌株诱变化学诱变,精选,8,1.错误掺入诱变,错误掺入突变指在体外DNA扩增过程中,使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件,使碱基错误掺入到新合成的基因中TaqDNA聚合酶无3-5外切活性碱基错误掺入率10-7-10-3,20-25循环,10-3/bp但是:突变大多数为碱基置换,有很强的倾向性.如ATGC碱基转换transition突变的频率是碱基颠换transversion的2倍,精选,9,易错PCR（error-pronePCR）是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率,降低聚合酶固有的突变序列倾向性,提高突变谱的多样性,使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中,从而得到随机突变的DNA群体,最后用合适的载体克隆突变基因。连续易错PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。合适的DNA长度1kb,更长的扩增效率降低,精选,10,方法：增加MgCl2浓度到7mM,稳定非互补的碱基配对增加聚合酶量到5U,促使在错配碱基处继续延伸反应降低一种dNTP的量（降至1-10）.在缺乏正确核苷酸时,聚合酶经短暂停留后,会插入另外3种可用核苷酸的一种加入次黄嘌呤dITP来代替被减少的dNTP,能与C、T、A配对缓冲液中另加0.5mmol/LMnCl2,Mn2+能降低聚合酶对模板的特异性增加dCTP和dTTP的浓度到1mM，促进错误掺入使用突变DNA聚合酶如MutazymeGCAT,精选,11,易错PCR,精选,12,2.盒式诱变(cassettemutagenesis),简单的盒式取代诱变：通过限制性酶切除去特定的双链DNA片段，再与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接，得到取代突变，是一种定点诱变混合寡核苷酸诱变：用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，可在限定区域内引入大量的随机突变,精选,13,精选,14,精选,15,3.增变菌株诱变,增变菌株诱变作用是在活体细胞中进行,诱变的目的基因是克隆化的外源基因增变菌株:由于DNA复制酶具有校正功能,以及细胞内DNA复制后修复系统的存在,大肠杆菌自发突变频率较低.与DNA错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后细胞内基因的突变频率大大增加,这样的菌株叫做增变菌株.,精选,16,将携带待突变目的基因的质粒导入增变菌株中扩增若干代,即可得到随机突变体库,再将该库的重组DNA转化到或亚克隆到正常宿主中筛选、鉴定突变体。常用的大肠杆菌增变菌株：XL1-Red（mutD、mutS、mutT），随机突变频率10-3/（bp代）mutD突变DNA聚合酶的35外切活性缺陷，失去错配碱基的校正功能mutS突变DNA错配修复系统失去功能mutT突变不能水解dGTP的氧化产物8-oxodGTP，8-oxodGTP在复制时掺入DNA中，造成突变,精选,17,4.化学诱变,用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中，构建成一个重组突变体库。用适当的功能分析可鉴别携带突变的重组子。化学诱变剂：亚硝酸、羟胺、亚硫酸氢盐、肼等,精选,18,第二节DNA体外重组,DNA体外重组技术:指依赖序列同源性的DNA体外重组，包括：DNA洗牌（DNAShuffling）交错延伸（staggeredextensionprocess，StEP）随机引发重组（random-primingrecombination，RPR）,精选,19,一、DNA洗牌（DNAShuffling）,DNA“洗牌”又称DNA改组技术,或DNA体外随机拼接技术,它依赖PCR,又不完全等同于传统的PCR技术,所以,DNA体外随机拼接又称为有性PCR。指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(SexualRecombination)。通过改变单个基因(或基因家族，genefamily)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。,精选,20,DNAshuffling体外基因突变一般过程如下(1)获得目的基因:选择一组分别具有一系列所需性状的基因序列作为重组的亲本,亲本之间有序列同源性(60%).亲本可以是经随机诱变得到的一组有益突变体,或天然存在的基因家族.常用的有两种方法。为了增加突变率采用PCR扩增目的基因回收为了增强保真性，可以采取抽提含有目的基因的质粒，通过酶切回收。可以根据不同的需要任取其中一种方法。,精选,21,(2)基因酶切回收:采用DNaseI消化基因DNA得到10-50bps或100-300bps的片段，酶切过程中用Mn2+能提高保真性3倍左右。(3)无引物PCR:切割的DNA片段通过相互间的同源随机互补并互为引物,经PCR扩增,获得大量随机组合的新DNA突变体.为确保得到高保真性的片段，应在较高的温度下复性。同标准PCR,先对dsDNA进行热变性,退火时单链片段与足够长度互补序列的其它单链配对,形成3或5突出端,聚合酶延伸3凹端.反复循环，随着循环数增加,片段的平均长度也增加,最后达到DNA亲本序列的原始长度.,精选,22,(4)有引物PCR:将无引物PCR产物作适当稀释，作为模板进行PCR，加入特定两侧引物进行最后的PCR扩增,便可获得全长基因的PCR产物。(5)目的突变基因的获得:回收目的片段克隆到载体上，转化选择所需的突变了的目的基因。如筛选抗性基因、高酶活基因等,精选,23,DNase处理,无引物PCR片段重装配,DNA洗牌法原理图,反复循环,精选,24,有引物PCR,克隆筛选,精选,25,精选,26,DNAShuffling技术能模拟生物的基因在数百万年间发生的分子进化过程，并能在短期的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高成千上万倍的功能性突变基因。,DNAShuffling与常规定向进化的比较,精选,27,实例:1994年，美国的Stemmer采用单个基因的DNAShuffling和回交技术，在大肠杆菌中使编码-内酰胺酶的TEM-I基因的抗生素抑制活性(MIC)从0.02ug/mL提高到640ug/mL,即提高了32,000倍。次后，他们又相继选取了绿色荧光蛋白基因(gfp)和-半乳糖昔酶基因(lac)(1997)用DNAShuffling技术模拟并加速了分子进化过程。筛选获得了酶活性大幅度提高的突变株1996年，Moore等亦采用该技术对降解污水中有机污染物的对硝基苄基酯酶基因进行了定向模拟分子进化研究。1998,Crameri等采用4个不同来源的先锋霉素基因混合进行异源基因组的DNAShuffling，使单一循环的Mic活性提高了270-540倍。而同时只用单一基因进行的实验仅提高了8倍。,精选,28,二、交错延伸重组（staggeredextensionprocess，StEP）,将DNAShuffling技术进一步改进的DNA体外重组技术核心技术:有性PCR,在一个反应体系中以2个以上有一定序列同源性的DNA片段为模板进行PCR反应,通过变换模板机制实现DNA序列的重新组装,精选,29,交错延伸重组的一般过程如下(1)获得目的基因:选择两个以上有一定序列同源性的分别具有优良性状的亲本基因作为PCR模板省去用DNase将DNA切割成片段及片段纯化步骤,简化了程序(2)短暂PCR反应在每轮循环中,退火和延伸反应控制在短暂的时间(5s),引物先在一个模板链上延伸,只能合成出很短的新生链.经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火后继续进行短暂的延伸,此过程反复进行,直到产生全长的基因,得到间隔地含不同模板序列的杂交DNA分子.,精选,30,(3)两端引物PCR:加入两端引物作标准PCR反应,扩增全长的杂交DNA链。(4)目的突变基因的获得:回收目的片段克隆到载体上，从得到的DNA文库中选择或筛选得到性状优化的基因,精选,31,精选,32,三、随机引发重组（random-primingrecombination，RPR）,原理:用一套随机引物与模板配对延伸,产生互补于模板不同位点的短DNA片段混合物,由于碱基的错配和错误引发,这些短的DNA片段中也会有少量点突变,在随后的PCR反应中,这些短的DNA片段互为引物重新组装产生全长的基因模板:一条DNA单链或cDNA,精选,33,随机引发重组的一般过程如下(1)随机引发合成短DNA片段混合物:以变性DNA为模板,加入随机引物,用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段进行延伸反应,得到长短不一的新生DNA片段(50-500bp)(2)过滤、纯化DNA片段混合物去除模板、长的新生DNA片段、小的新生DNA片段（30bp），蛋白质和引物.(3)无引物PCR.新生DNA片段互为引物,重新组装产生全长的杂交DNA链(4)标准PCR加入特异的两端引物,后同DNA洗牌法,精选,34,精选,35,第三节寡核苷酸介导的定点诱变p176,基因的定点诱变（site-directedmutagenesis）:使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失突变的过程需一个或多个含突变碱基的诱变寡核苷酸作为引物进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一部分,精选,36,一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程,三个步骤：突变寡核苷酸引物的合成：化学合成能与野生型DNA模板的靶区域退火、并携带所需突变的寡核苷酸，作为体外合成DNA的引物由DNA聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸，产生含有预定突变的双链DNA模板：ssDNAordsDNA。DNA片段，诱变合成后克隆到载体上；完整的质粒（9kb）3.测序。对突变体DNA进行测序，验证靶点的突变，确保其它区域没有发生额外的突变,精选,37,二、诱变寡核苷酸引物的设计,设计原则：与靶DNA的适当链互补，与靶的其它区域不能错误杂交足够的长度与靶序列特异结合，1-2个碱基改变的引物要求至少25bp长3.错配碱基位于中央位置，使每侧有10-15bp与模板链完全配对。有效引入多于3个核苷酸突变时，要求引物在诱变点的每侧有30个核苷酸与模板互补4.5端与模板完全互补，从上游引物起始的DNA合成不会取代诱变寡核苷酸,DNA聚合酶的53外切核酸酶活性是造成上游DNA合成取代5核苷酸的原因,精选,38,5.诱变寡核苷酸引物3区域有10-15bp与模板链完全配对，形成足够稳定的杂交分子，有效地从诱变寡核苷酸引物3端引发DNA的合成6.无回文、重复或自身互补序列，否则，形成二级结构，与靶序列杂交率降低，导致得不到突变体7.必要时可在诱变寡核苷酸上加上新的酶切位点，或消除靠近诱变点的已有酶切位点，便于诱变后通过限制酶消化筛选侯选突变子,精选,39,三、经典DNA定点诱变,70年代初174DNA（ssDNA5386bp），当用带琥珀突变的ssDNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象。即产生带野生型基因组的噬菌体，原因是野生型DNA片段与突变体的相应序列退火，形成错配的异源双链体，后者可被宿主编码的错配修复系统转变为全长的野生型基因组。由此可利用突变的DNA片段将突变引入到野生型DNA中。,精选,40,精选,41,(一)、Kunkel法或称“U”法,1背景介绍dut-：dUTP酶缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP，因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸腺嘧啶占据的位置。ung-：UDG酶缺陷，UDG酶尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基,产生脱碱基的位点。含有脱碱基的DNA链不再具备作为完整复制模板的能力,精选,42,制备单链DNA模板时用ung-dut-突变的大肠杆菌菌株如CJ236菌株，该菌株合成的DNA中部分胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。如M13噬菌体DNA中有20-30个尿嘧啶,精选,43,2原理Kunkel法过程包括：目标DNA插入phagemid载体并进入E.coliCJ236。由于该菌体ung-dut-突变，合成的DNA上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）M13K07辅助感染下，产生带U的单链DNA。与引入诱变的Oligo复性。,精选,44,在T7DNApolymerase和ligase作用下，以带U的单链DNA为模板合成一条新链，形成杂合双链。感染dut+ung+E.coliMV1190后，在细胞分裂过程中，只有新合成的DNA链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链DNA。而有U的DNA链，在dut+和ung+产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力。,精选,45,精选,46,3.Primer要求5端磷酸化。引物的终极条件：与靶DNA正确配对特异性地与靶DNA序列退火。,精选,47,A.单核苷酸置换插入或缺失5端完全配对，使得上游（引物）起始的DNA合成不容易将诱变寡核苷酸取代，约需8-10bp。3端所形成的杂交体足以引导DNA合成。如果错配核苷酸太靠近3端，3端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。所以3端需有7-9bp完全配对；,精选,48,为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸。一般17-19bp，错配在中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大。,精选,49,B.多处缺失或变换2个bp以上的oligo两侧需12-15bp侧翼双链区的Tm应约为35-40Tm=4（G+C）+2（A+T）突变区域大，效率越低（两侧形成稳定杂交体的能力是突变区长度的函数越低）。,4.模板/结果靶DNA尽可能短，应测序确定其突变。,精选,50,（二）位点选择诱变AlteredSitesinvitroMutagenesisSystem,使用了2个寡核苷酸引物一个是用来引入突变的突变引物一个是用来选择用的选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因，同时可用来选择引入突变的DNA链,精选,51,1.将目的片段克隆到载体2.得到重组质粒3.模板DNA碱变性，与突变引物、氨苄青霉素抗性基因修复引物（amproligo）和四环素抗性基因敲除引物（tetsoligo）同时退火4.用T4DNA聚合酶和T4DNA连接酶合成突变链5.转化大肠杆菌ES1301菌株（mutS），用氨苄青霉素筛选6.纯化质粒，转化大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素筛选7.必要的话，影印一份平板，鉴定四环素敏感的克隆子，从而获得突变体8.再做一轮诱变，修复四环素抗性基因并敲除氨苄青霉素抗性基因,精选,52,位点选择诱变原理图,精选,53,（三）转化子诱变TransformerSite-Directedmutagenesis,使用了2个寡核苷酸引物一个是用来引入突变的突变引物一个是用来剔除单一酶切位点的将待突变的DNA片段装载到克隆载体上，该载体上必须存在单一酶切位点。当这两个引物同时指导DNA合成时，突变的DNA链将不再含有单一酶切位点，而模板DNA在该位置能被切割。通过转化大肠杆菌，线性化的DNA不能复制，只有突变链保持环状，可以获得转化子,精选,54,精选,55,精选,56,（四）PCR介导的定点诱变,1.同源重组法,在一般宿主内发生同源重组,但需高转化效率,精选,57,精选,58,2.Dpn法,以反向PCR为基础,直接以含有目的基因的环状质粒为模板,用2个反向的、5端相邻且磷酸化的引物向2个反方向延伸,扩增出线性的双链DNA,然后用Dpn酶降解甲基化或半甲基化(只含有1条模板链)的模板链,而在体外合成的突变链不受Dpn酶的降解,这样可以净化突变的双链DNA。最后用连接酶连接形成带突变基因的环状质粒,精选,59,精选,60,3.重叠延伸PCR诱变法Overlapextension,对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链,精选,61,该方法需要4个引物,包括2个含有突变碱基的反向互补的引物,2个上、下游通用引物。整个诱变过程需要3个PCR反应分2轮进行。第1轮PCR的2个反应分别产生2个含突变位点的上下游DNA片段,这2个DNA片段的末端互补。第1轮PCR的产物需要经凝胶电泳纯化。第2轮PCR将上述2个PCR产物混合,通过末端互补配对互为引物延伸得到完整的含突变位点的全长DNA再用通用引物扩增诱变的全长的DNA,精选,62,5,5,3,3,精选,63,精选,64,4.重叠延伸剪接法Splicingbyoverlapextension,SOE,可用于将两个DNA片段在所期望的位点进行连接。核心:设计一对融合寡核苷酸引物包括两个步骤：设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在3末端，起引物作用；重叠部分在5末端。与待融合的DNA片段序列互补。设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补。下图为将某基因的启动子与另一基因的编码序列连接示意图,精选,65,基因A,基因B,精选,66,基因B:引物的5端部分为基因A的ATG密码子上游紧邻的序列,3端则为基因B从ATG密码子开始的序列基因A:基因B的融合引物与基因A的融合引物完全互补这两个融合引物各自与侧翼引物扩增的产物有完全同源的序列,可以进行重叠延伸,精选,67,基因A,基因B,P1,P2,精选,68,5.大引物PCR诱变法,大引物PCR法由KammannM等人于1989年提出,随后经SarkarG和SommerSS等人加以改进。该方法需2个侧翼引物和1个内部诱变引物,经过2轮PCR获得突变的全长DNA。第1轮PCR用诱变引物和1个侧翼引物,扩增产物经凝胶纯化后作为大引物再与另一侧翼引物进行第2轮PCR,产生全长的突变的DNA。,精选,69,PicardV,1994和Song-HuaKe,1997等分别建立了单管大引物PCR(Single-tubemegaprimerPCR)。单管大引物法省去第1轮PCR产物的纯化过程,实现在同一管中先后进行两轮PCR反应。Song-HuaKe提出的方案更加巧妙简单。需设计Tm值不同的2个侧翼引物,第1轮PCR反应用低Tm值的侧翼引物(F1)和诱变引物,用较低的退火温度,扩增反应产生大引物。然后再加入高Tm值的侧翼引物(F2)在较高的退火温度下进行第2轮的反应,扩增出全长的含突变位点的DNA产物。,精选,70,单管大引物PCR诱变,精选,71,6.以PCR为基础的定点诱变技术存在的问题及解决对策,1）.诱变产物的忠实性PCR产物有相对高的错误率,除目的突变外,常包含一些非预定突变。可以通过以下2个方法将错误率降到最低。限制扩增的循环数应用更好的热稳定DNA聚合酶,如Pfu,Vent等,它们具有35外切酶活性,并具有校正功能,精选,72,2）.诱变的效率提高诱变效率是以PCR为基础的定点诱变面临的问题。通过PCR条件的优化、不同Tm值的引物的巧妙的设计、不对称扩增、把引物标记上生物素分离突变DNA等手段可以提高诱变效率。PCR定点诱变方法的不断创新和发展使得分子生物学关于基因和蛋白质的结构与功能的基础研究和基因工程中定点改造目的基因更加简便、高效、低耗。,精选,73,第四节嵌套缺失,嵌套缺失(NestedDeletions)的制备主要依赖核酸酶,如核酸外切酶(Exonuclease,Exo),BAL31或DNase,这些酶可以特定的作用方式消化DNA,同时消化DNA的速率可控制,因此能同时分离嵌套缺失和多组终末端相差无几的缺失体利用该技术可构建一系列梯度缺失重组子,借此可对该段DNA分子上的重要功能区进行定位,用于寻找在基因表达调控中起关键作用的启动子和增强子等顺式作用元件,精选,74,1.核酸外切酶(Exonuclease,Exo)的消化,原理：就是利用核酸外切酶(Exonuclease，Ex