自配试剂记录

快速、低成本从斑马鱼组织中提取用于PCR的DNA试剂：50mM NAOH 1/10th 体积的1M Tris-HCL，PH 8.0 一管式通用样品 DNA抽提试剂盒组分 SK8401，100 次 Qlysis-G Reagent 10 ml Proteinase K 1 ml Buffer NST 10 ml 一管式通用样品 DNA抽提试剂盒组分SK8402，500 次Qlysis-G Reagent 50 mlProteinase K 5 mlBuffer NST 50 mlQlysis-G Reagent：NaCl 400mM Tris-base pH8.0 10mM EDTA pH8.0 100mM SDS 0.6%Proteinase K：20mg/ml （将 200mg 的蛋白酶 K 加入到 9.5ml 水中，轻轻摇动，直至蛋白酶 K 完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到 10ml，然后分装成小份贮存于-20。）Buffer NST：盐酸胍 6M 用 HAc 调 pH5.0水浴时间：65 C 10 min95 C 5 min石蜡组织提取DNA0.1M NAOH 0.4g/100ml 水 一步消化法：向 个装有切片的离心管中各加入消化液（蛋白酶 ， ，），分别在 下消化 、和 ，消化中每 振荡混合次。煮沸灭活蛋白酶 ，离心 ，吸取 上清至另一离心管中，保存。以一步消化法消化 组、组和 组提取的基因组 为模板，扩增得到 基因 片段，产物经凝胶 回收试剂盒（，美国）纯化后用 自动测序仪进行测序RECIPES：ACD0.48% w/v柠檬酸1.32% w/v柠檬酸钠1.47% w/v葡萄糖ACD溶液B用于新鲜或者冷冻血液样本Ammonium Acetate配置10M溶液1L，溶解770g乙酸铵于800ml水中，用水定容至1L，过滤灭菌。或者配置100ml溶液，室温溶解77g乙酸铵于70ml水中，加水定容至100ml。0.22um滤膜过滤灭菌，储存溶液于密封瓶中，4或者室温储存。Dialysis Buffer 6-150 mM Tris-Cl (pH 8.0)10 mM EDTA (pH 8.0)4储存EDTA制备0.5 M (pH 8.0) EDTA：加入186.1g二水合乙二铵四乙酸二钠disodium EDTA2H2O于800ml水中，磁力搅拌器大力搅拌，用NAOH调PH至8.0（约20g NAOH）。分装高压灭菌。KCl溶解适量的KCl，高压灭菌20min，室温储存。最好4M该溶液分装至每无菌试管100ul，每管用一次丢弃。Mammalian Cell Lysis Buffer10 mM Tris-Cl (pH 8.0)0.1 M EDTA (pH 8.0)0.5% (w/v) SDS20 g/ml DNase-free pancreatic RNase前三样可以按试剂要求量配好室温储存，RNase在实验使用时在加入要求的量。胰RNase在0.5% SDS中活性不高，但是如果加入浓度高，足可以除去RNA。NaCl制备5M溶液：溶解292g NaCl于800ml水中，加水定容至1L。分装高压灭菌，室温储存。PBS137 mM NaCl2.7 mM KCl10 mM Na2HPO42 mM KH2PO4（磷酸盐缓冲液）溶解8g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4于800ml蒸馏水中，用HCl调PH值到7.4。加水定容至1L。分装15 psi (1.05 kg/cm 2)高压灭菌20min。室温储存，如果有需要，PBS可以加入1 mM CaCl2 和 0.5 mM MgCl2。Phenol平衡至PH7.8，操作时戴手套，面部防护，穿实验服。1. 液态酚-20C储存，使用时室温溶解，68C溶解，加入羟基喹啉至最终浓度0.1%。这个混合料是一种抗氧化剂，对RNase有部分抑制作用，和微量的金属离子螯合剂对调作用。此外，它的黄颜色能够很轻易的识别出有机相。2. 对于融化苯酚，加入等体积的缓冲液（通常0.5 M Tris-Cl pH 8.0，室温）。磁力搅拌混合15min。关掉搅拌器，等到两相分离，用 枪头的真空玻璃管尽量抽提除去上层。3. 加入等体积的0. 1 M Tris-Cl (pH 8.0)，磁力搅拌混合15min。关掉搅拌器，等到两相分离，用 枪头的真空玻璃管尽量抽提除去上层。重复抽提直至酚相pH 7.8。4. 苯酚平衡好之后加入含有0.2%巯基乙醇的0.1体积的0.1 M Tris-Cl (pH 8.0)。苯酚溶液4C避光储存在100 mM Tris-Cl (pH 8.0)中1个月。Proteinase K20mg/ml蛋白酶K配制标准（proteinase K）：将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20。(20 mg/ml)溶于灭菌的50 mM Tris (pH 8.0)，1.5 mM乙酸钙中。分装至小管-20C储存。避免反复冻融。和其它的天然蛋白酶（如链霉蛋白酶）不同，蛋白酶K在使用之前不需要自我消化。SDS十二烷基硫酸钠。制备20% (w/v)溶液，溶解200g电泳级SDS于900ml水中，加热至to 68C并磁力搅拌加速溶解，如果有需要的话，加入少量浓HCL调PH至7.2。用水定容至1L，室温储存。无需高压消毒灭菌，TBS溶解8 g NaCl、0.2 g KCl、3 g Tris base于800ml蒸馏水中，加入0.015 g酚红，用HCL调PH至7.4。加蒸馏水定容至1L。分装至小管，15 psi (1.05 kg/cm 2)高压灭菌20min。室温储存。TE100 mM Tris-Cl (desired pH)10 mM EDTA (pH 8.0)15 psi (1.05 kg/cm 2)高压灭菌20min，室温储存。Tris-Cl溶解121.1 g Tris base于800 ml水中，用浓HCL调所需要的PH值。pH HCl 7.4 70 ml 7.6 60 ml 8.0 42 ml (1 M)：调PH值之前室温冷却，用水定容至1L，分装至小管，高压灭菌。如果1 M溶液呈黄色，丢弃掉，重新购买质量好的Tris。该溶液的PH值与温度相关，每升高1C大约降低0.03 pH单位。如0.05 M 溶液在5C, 25C, 37C时的的pH 值分别为9.5, 8.9, 8.6 。PCR产物纯化配方：5l SAP（虾碱酶，Shrimp Alkaline Phosphatase, 500u，1u/l），加入25l exo1 E.CO1i（外切酶，Exonuclease I,E.coli，4000u，20u/l），加入170l灭过菌的去离子水，在震荡器上混匀，放入冰箱冷冻室保存。测序前，PCR产物纯化 纯化反应可除去未掺入PCR产物的引物和核苷酸。纯化的PCR产物可直接用于测序，无需进一步纯化(如过柱离心试剂盒)。 1. 反应体系配方如下：PCR 混合物 (直接来自于PCR反应产物)5lExonuclease I (Exo I)0.5l (10 u)FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase 或Shrimp Alkaline Phosphata