应用红外光谱研究生物大分子的结构

应用红外光谱研究生物大分子的结构谢孟峡 刘媛北京师范大学分析测试中心，北京 100875，一、蛋白质二级结构的测定蛋白质的空间结构主要有四级，其结构层次示意图见图1。稳定蛋白质三维结构的主要作用力有五种，分别是盐键、氢键、疏水作用、范德华力和二硫键。这些都是共价键相互作用，其中对于二级结构，最重要的作用力是蛋白质分子中的氢键。图1 蛋白质结构层次示意图其中：Q为四级结构，T/为由结构域组成的三级结构或亚基，D/T为结构域或三级结构，sS为超二级结构，S为二级结构，A为组成一级结构的氨基酸在所有已测定的蛋白质中，都有广泛的二级结构存在。蛋白质的二级结构形式主要包括-螺旋、-折叠、-转角和无规卷曲四种。这些二级结构中将螺旋看成蛋白质复杂构像的基础，折叠是蛋白质中又一种普遍存在的规则构像单元。无论是螺旋还是折叠都存在着许多氢键，致使规则的二级结构都具有相当的刚性，如果一段肽链中没有氢键或其他相互作用，那么各个残基之间就有更大的自由度，转角就是典型的介于此两种情况之间的一种二级结构，是一种部分规则的构像（见图2）。此外还有一些肽段相对于前面的三种二级结构是无规则，它们有更大的任意性，可是这些肽段的构像又不是完全任意的，因为每种蛋白质肽链中存在的这一类型空间构像几乎是相同的，所以蛋白质中无规卷曲也是具有其特定构像的。螺旋平行和反平行折叠转角图2、蛋白质典型二级结构示意图蛋白质二级结构特征与氢键的形成方式紧密相关，无论-螺旋、-折叠、-转角或其它构象，都有其特定的氢键结构，而这种氢键结构的差异能够在对于氢键敏感的红外光谱中得到反映，主要表现为谱带峰位及半峰宽的变化。这使我们有可能利用峰位不同的谱带来识别不同的二级结构及其组成情况。图3 人血清白蛋白（HSA）在重水中的红外吸收谱在蛋白质的红外光谱中，无论是酰氨I带还是酰氨III带，都由代表了不同二级结构的谱峰重叠而成。可以通过曲线拟合将重叠在一起的谱峰分开。曲线拟合的一般步骤是，首先对得到的蛋白质相应的谱带进行基线校正，然后采用二阶导数和傅立叶去卷积确定了子峰数目和各子峰位置，通过调整各子峰的高度及半峰宽得到满意的曲线拟合谱图，最后根据拟合谱峰的峰面积定量计算不同二级结构的含量。对于各子峰的归属我们也已经做了较多的研究【】。酰氨I带中，-螺旋：1652 cm-1 (H2O); 1650 cm-1 (D2O); 1656 cm-1 , 1658 cm-1 ；非标准-螺旋（310Helix）：1660 cm-1；-折叠：1635 cm-1，1625 cm-1，1620 cm-1 ；反平行-折叠：1693 cm-1 (H2O); 1675 cm-1 (D2O); 但1675 cm-1 的强度只有低波数的1/10.-转角： 1660 cm-1 1700 cm-1无规结构：1657 cm-1 (H2O); 1643 cm-1 (D2O)。酰氨III带中，-螺旋：13301290 cm-1；-折叠：12501220 cm-1；-转角：12951265 cm-1；无规结构：12701245 cm-1；【高等学校化学学报 2003】图4 蛋白质酰氨I带合酰氨III带拟合结果目前蛋白质的两个谱带分析其二级结构都有一点的局限性，如酰氨I带虽然谱峰归属比较成熟，但是受水汽干扰很严重；而酰氨III带虽然不受水汽干扰，而且不同二级结构在这里的吸收更加特征，但是由于其信号较弱一直以来也没有得到广泛的应用。我们首先提出了将酰氨I带和III带结合起来定量分析蛋白质二级结构的相对含量的方法，该方法可以扬长避短，更加准确的分析蛋白质二级结构。二、药物与蛋白质相互作用的研究药物在人体内的分布是由蛋白质控制的，它们由人血清白蛋白储存、携带到达目标组织。药物与蛋白质相互作用强度可以用来对药物进行筛选。因此研究药物与蛋白作用机理具有十分重要的意义，可以对药物分子的设计提供理论依据。多酚类药物主要包括脂肪多酚有机化合物、多酚苯乙烯酸系列化合物、多酚苯甲酸系列化合物、单宁酸和黄酮类药物。多酚有机酸包括脂肪酸和芳香酸，其中芳香酸有可大致分为苯乙烯酸系列和苯甲酸系列。目前研究药物与蛋白质相互作用的方法主要有荧光光谱、紫外光谱、平衡透析法以及红外和拉曼光谱法等等。利用红外光谱法可以分析蛋白与药物作用前后二级结构的变化。利用差谱技术观察药物与蛋白质作用前后红外光谱的变化，推测药物与蛋白质作用的主要基团，蛋白质中氨基酸残基侧链吸收峰的信息，如Tyr, 1515cm-1， His, 1105 cm-1等 。同时可以结合其它方法对结合机理、结合部位进行推测。以人血清白蛋白（HSA）和苯乙烯酸系列有机酸的相互作用为例，通过红外光谱分析计算可得到蛋白质与药物作用前后二级结构的变化。结果见表1。其中CI为肉桂酸；CO为香豆酸；CA为咖啡酸。表1 HAS与苯乙烯酸系列有机酸作用后二级结构的变化苯乙烯酸系列有机酸（n1）药物CI（0.4）CO（11）CA（16）-螺旋（）-2.5-4.9-8.1-折叠（）-1.5-0.7-1.9-转角（）2.74.07.7无规结构（）HAS与氯原酸（CLA）和阿魏酸（FA）相互作用后-螺旋分别减少7和5；-转角分别增加约4和3；无规结构约增加3。结合荧光光谱测得二者与HAS的结合位点数均为1，结合强度分别为氯原酸4.37 104 M-1，阿魏酸2.23 104 M-1。蛋白质与药物作用前后其酰氨I带和III带的拟合谱图见图5图5 HAS与药物作用前后酰氨I带和III带谱图拟合结果人血清白蛋白与另外三个不同结构有机酸，芥子酸（SA）、没食子酸（GA）和莽草酸（SI），相互作用研究后发现，HSA与实验中最大浓度的芥子酸作用后-螺旋和-折叠分别减少了6.2%和2.0%，-转角和无规结构分别增加了5.0%和3.2%；芥子酸在HSA上有两个结合位点，表观结合强度分别为2.5103 LMol-1和4.9108 LMol-1。与没食子酸作用后-螺旋和-折叠分别减少了5.2%和1.5%，-转角和无规结构分别增加了5.4%和 1.3%；一个结合位点，KA为1.1104 LMol-1。这三种有机酸的结构见图6。图6 a芥子酸，b没食子酸，c 莽草酸水解单宁酸（PGG）与蛋白质的相互作用同样可以应用红外光谱进行研究，结合酰氨I带和III带结果发现，与药物作用后蛋白质结构变得松散。与PGG作用后，蛋白质的-螺旋结构降低了约8，-转角和无规结构分别增加了约6和4 ，数据结果见表2。荧光结果显示随着PGG浓度的增加，它在HSA上有两个个结合位点。表观结合强度分别为1.66104 Lmol-1 和8.98108 Lmol-1 。人血清白蛋白（HSA）分子是一个含有585个氨基酸残基的单链多肽链，形成9个回折，其间以二硫键相连。通常可以将HAS分子划分为三个结构域（I、II、III），每个域又包含两个子域（IA、IB、IIA）。HAS分子中有两个主要的活性位点，site I位于IIA子域，主要可以和电荷位于分子中央的较大的杂环阴离子结合；site II位于IIIA子域，主要可以结合负电荷位于一端的长链脂肪羧酸。上文中谈到的几种有机酸结合位置研究发现，CI、CO、CA、FA和GA在HAS上只有一个结合位点，它可能结合在site I的IIA亚域，而CLA结合在IIIA亚域。SA和PGG低浓度时在HAS上有一个结合位点，但是在高浓度时出现了第二个结合位点。应该分别结合在IIA和IIIA亚域。第一个位点的结合使蛋白质结构发生了变化，激活了第二个结合位点。表2 与水解单宁酸作用前后HAS的二级结构变化CPGG/CHSAAmide-helix (%)-sheet (%)-turn (%)Coil (%)0I54.30.423.10.40.1III54.10.323.50.30.20.01I6.50.1IIII0.30.3III50.70.51I45.80.421.70.422.30.410.20.3III46.40.32I11.60.2III45.60.322.00.30.33I45.00.50.311.90.2III45.40.322.70.40.1苯乙烯酸、苯甲酸和单宁酸等与蛋白质都有特征性的结合，而莽草酸基本上不与蛋白质结合。莽草酸分子不具有芳香性，其它几种药物都具有芳香性。从药物结构分析药物与蛋白的结合机理，可知COO-1，苯环、酚羟基在结合过程中起到了重要作用。人血清白蛋白分子中的活性位点Site I 和 Site II 结合腔的内壁主要由疏水性氨基酸残基组成，而腔的入口处是带正电荷的碱性氨基酸。药物分子中的COO与腔口带正电荷的碱性氨基酸 Arg257、Arg222、Lys199、His242、Arg218和Lys195发生静电吸引，靠近结合腔。 苯环与腔中的疏水性残基，如Leu219、Phe223、Leu234、Leu238、Leu260、Ala261等发生疏水性相互作用。酚羟基与腔体中的Trp214、Glu292、Phe 211等氢键给予体形成氢键 。酚羟基与主肽链的C=O、N-H等基团之间形成氢键，破坏了主链原有的氢键网络，使蛋白质的二级结构发生变化。主要体现在-螺旋 结构的降低，转角结构增加，使蛋白质的亲水性增加，荧光发射峰红移。PGG与HSA间的强相互作用也是由其分子结构决定的（其分子结构见图7）。 PGG分子体积大酚羟数多，非常有利于药物分子和蛋白质之间的结合，特别是多个酚羟基与蛋白质主链及侧链氨基酸之间的氢键作用，使PGG可以牢固的结合在蛋白质上，同时也使维持蛋白质空间结构的力体系发生了改变，导致其结构发生较大变化。当CPGG/CHSA0.5时PGG在HAS上的结合位点数n=1，0.5CPGG/CHSA3时n=2，从两个位点的表观结合常数kA和第一个结合位点的结合常数kA数量级来看，HSA在PGG浓度高时出现的第二个结合位点对PGG的亲合力并不亚于第一个结合位点。 但PGG并未在低药物浓度时与这两个位点都发生结合。第二个结合位点可能是在PGG与HSA上第一个位点发生作用引起蛋白质构象发生变化以后才形成或者暴露出来的。 图7 -1,2,3,4,6-五-O-倍酰-D-葡萄糖(PGG) 的结构Baxter等人研究了没食子酸丙酯、-1,3,6-三-O-倍酰-D-葡萄糖(TGG)和PGG与富脯氨酸肽段(PRP)的相互作用，发现它们之间主要的作用模式为多元酚苯环与脯氨酸之间的疏水力堆积作用。小体积的多元酚靠苯环与一个脯氨酸残基发生疏水作用，体积较大的单宁酸则可以和PRP肽段中连续的两个或三个脯氨酸发生作用。Baxter等还研究了单宁酸和球蛋白之间的相互作用，发现它们之间还可通过单宁酸的苯环与暴露于球蛋白表面带苯环的氨基酸残基间发生疏水作用。三、光动力作用对蛋白质结构的影响光动力作用产生的自由基能引起蛋白质的失活、断裂、集聚、侧链氧化、变性、水解活性变化、疏水性变化、构象改变、新反应物形成等。蛋白质自由基形成后都会引起其结构改变，这一过程的具体机制还不清楚。以前认为，自由基最初改变一些作为接收器的氨基酸残基（如Cys、Tyr、Trp），这一作用再通过其它方式影响其余的氨基酸，最终导致蛋白质结构的变化，但是，最初的作用位点和作用的转移方式都不清楚。在有氧条件下将蛋白质置于能产生自由基的物化环境中，发现了蛋白质过氧化物的存在，这些过氧化物在金属离子存在时被分解，生成反应力更强的自由基。这些自由基是引起蛋白质结构的进一步破坏或链式氧化反应的关键 。我们通过红外光谱研究了光动力作用对细胞表面蛋白结构的影响，结果从光动力作用前后蛋白质红外光谱的差谱中就可以明显的看到变化，见图8。经过谱图拟合计算后发现光动力作用之后，细胞表面蛋白有从有序结构向相对无序结构转变的趋势，见表3。表3 光动力作用对细胞表面蛋白结构的影响-H