免疫检测

第十八章,免疫学检测方法,免疫学检测方法,免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。,第一节 检测抗原抗体的体外方法,一、抗原抗体反应的特点：1、抗原抗体结合的特异性 特异性互补结合 共同抗原 交叉反应（非特异性反应）2、抗原抗体结合的可逆性 Ag + Ab Ag Ab complex,抗原抗体分子结合的特点：,非共价键结合 范德华力分子空间构型的互补程度 静电引力 氢键 疏水性作用 抗原抗体解离 解离程度取决于抗体亲和力的大小,一、抗原抗体反应的特点：,3、抗原抗体结合的比例性,免疫复合物中抗原和抗体的量,4、抗原抗体反应的阶段性与可见性,抗原、抗体在溶液中均属胶体物质，带有电荷，与水有强亲和力，为亲水胶体。在一定pH溶液中，胶体粒子所带的阴电荷和阳电荷相等，为等电点（pI）； 溶液pH pI时，羧基电离，胶体粒子带阴电荷 溶液pH pI时，羧基电离，胶体粒子带阳电荷特异性结合阶段可见反应阶段： 凝集现象 沉淀现象,二、抗原抗体反应的主要影响因素,电解质温度pH,三、抗原、抗体的制备,抗原制备 颗粒性抗原：细胞性抗原 可溶性抗原抗体制备 多克隆抗体 单克隆抗体,四、体液免疫检测技术,传统的血清学方法1.凝集反应 (Agglutination)颗粒性抗原抗体 凝集可溶性抗原相应抗体 不 凝集可溶性抗原无关载体抗体 凝集常用载体 RBC 聚苯乙烯乳胶 活性碳 胶体金,凝集反应的类型,直接凝集反应：颗粒性抗原相应抗体 凝集现象 玻片法 试管法 微量凝集法间接凝集反应： 可溶性抗原无关载体 抗体 凝集,凝集反应的类型,间接凝集抑制试验可溶性抗原？ 凝集现象（） Ag（） 致敏载体 抗体 凝集现象（） Ag（）协同凝集试验 SPAIgG SPA-IgG + Ag 凝集？,2.沉淀反应 precipitation,可溶性抗原相应抗体 沉淀物方法：1、单向琼脂扩散2、火箭电泳单向琼脂扩散电场3、双向琼脂扩散4、对流免疫电泳双向琼脂 扩散电泳5、散射比浊 （ 敏感、精确、自动化）6、速率散射比浊,3.补体结合试验complement fixation test , CFT,Ag,Ab,补体,SRBC,Anti-SRBC,溶血,不溶血,检测系统,指示系统,Ag(-),Ag(+),4.中和反应neutralization,病毒中和试验 Ab(-) 待检血清 病毒 细胞 细胞感染 Ab(+) 毒素中和试验待检血清 外毒素 毒素活性作用丧失抗链球菌溶血素“O”试验,第二节 免疫标记技术immunolabelling technique,用酶、荧光素、同位素等物质标记抗体或抗原进行抗原抗体反应，检测抗原或抗体的技术。1 . 常用标记物质： 酶：HRP、AP 荧光素：FITC、RB200 放射性同位素 胶体金 电子致密物质:2 . 用途：免疫组织化学技术：用于 抗原定位（组织切片、 细胞涂片、活体定位），在细胞或亚细胞水平上观察鉴定抗原、抗体、受体等。免疫定量测定：用于液体标本中抗原或抗体含量的测定。,一、免疫荧光技术,、荧光素：1、异硫氢酸荧光素（黄绿色荧光） fluorescein isothiocyanate,FITC,495nm2、罗丹明（红色荧光） Lissamine rhodamine B,RB200,3、R藻红蛋白 R-pheoerythin,R-PE、荧光显微镜,常见免疫荧光技术的方法,1.荧光抗体染色技术 直接荧光法 间接荧光法2.荧光免疫测定技术 时间分辩荧光免疫测定（time resoloved fluorescence immunoassay, TR-FIA）,二、免疫酶标记技术Immunoenzymatic technique,用酶标记抗体或抗抗体进行的抗原抗体反应，以底物被酶分解后的显色深浅来反应待检样品中抗原或抗体的含量。1、常用酶： 辣根过氧化物酶 （Horseradish peroxidase, HRP） 碱性磷酸酶 （Alkaline phosphatase, AKP）2.常用方法：免疫组织化学技术酶联免疫吸附试验, 酶联免疫吸附试验Enzyme Lined Immunasorbent AssayELISA,原理：一种固相免疫酶技术 固相载体的种类： 聚苯乙烯板 聚苯乙烯小珠基本方法：、间接法、双抗体夹心法、抗原竞争法检测仪器,生物素亲和素放大系统Biotin avidin system, BAS,将酶标记在生物素或亲和素上，借助生物素与亲和素的高度亲和力、生物素能与抗体结合的特点，应用于ELISA、放射免疫、免疫荧光、免疫电镜等技术中，可显著提高检测的敏感性。一个Ig分子可偶联90个生物素分子，一个生物素分子可结合4个亲和素分子；BAS的优点：生物素酶标亲和素系统（Biotin-avidin system-ELISA，BAS-ELISA）比标准ELISA的敏感性提高8倍。BAS的缺点：亲和素是PI较高的糖蛋白，对聚苯乙烯、硝酸纤维素膜、DNA有较高的非特异吸附，在ELISA、免疫组化、DNA杂交等检测中应用出现较高的背景着色。,斑点免疫渗滤试验（dot immunofiltration assay, DIFA）步骤：将蛋白样品滴加在作为固相载体的纤维薄膜上按ELISA操作膜上出现染色斑点酶联免疫电转移印渍法（enzyme linked immunoelectransferblot） 步骤:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳转移电泳酶免疫定位,生物素链酶亲和素系统Biotin -streptavidin system,链霉亲和素（streptavidin ,SA）PI为6.0，是一种与亲和素有相似特性的一种蛋白质，由亲和素链霉菌产生（streptomyces avidinii）。由于其非特异性结合远比亲和素低，有取代亲和素的趋势。,三、放射免疫分析法Radioimmunoassay,RIA,同位素分析的灵敏性 抗原抗体反应的特异性 优点： 灵敏度高 特异性强 精确性好 样品用量少 测定方法规范、自动化常用同位素：125I、131I、 3H、14C、32P,放射免疫测定法,1、基本原理 Ag* + Ab Ag*-Ab（B） （ 标记抗原，F） （ 特异抗体 ） （ 标记抗原抗体复合物） Ag(非标记抗原，F） Ag-Ab(未标记抗原抗体复合物，B）Ag*-Ab、 Ag-Ab为结合型（B）Ag*、Ag为游离型（F）,测定B、F放射活性 计算B/F值（放射结合率） 绘制标准竞争抑制曲线根据检测样品的B/F值，查得相应的抗原量,2、基本方法,三个关键性技术问题 制备高质量的抗体 抗原的纯化和标记 选择一种满意的分离技术，确保结合相（B）和游离相（F）分离 双抗体法 固相法 聚乙二醇沉淀法,放射免疫自显影法,免疫沉淀反应放射自显影,固相放射免疫测定,优点：敏感性略高于ELISA缺点：放射损伤的危险,四、免疫胶体金标记技术immunologic colloidalgoldsignature, ICS,免疫金银法胶体金斑点渗滤试验胶体金斑点免疫层析试验,常用抗原抗体反应的相对敏感度,反应名称 敏感度 （/L）血清蛋白电泳（区带电泳） 1000mg免疫电泳 50100mg单向免疫扩散 1020mg双向免疫扩散 10mg火箭电泳 5.0mg对流免疫电泳 1.0mg免疫比浊 1.0mg补体结合反应 10ug凝集反应 10ugELISA 10ugRIA 10ug,第三节 免疫细胞及其功能检测,一、免疫细胞的分离选择性分离细胞的依据：细胞大小、密度、表面电荷、粘附能力、细胞吞噬能力、细胞膜上的特异性标志等；,外周血白细胞的分离,1、加速红细胞沉降法： 6%右旋糖酐（MW200-400Kd） 肝素抗凝血 3%明胶 1%甲基纤维素2、低渗处理法：适用于用其他方法 分离WBC后残留的RBC的清除； RBCH2O1min + 等量1.8% NaCl RBC + 0.83% 氯化铵 溶解红细胞,外周血中单个核细胞分离,单个核细胞淋巴细胞单核细胞细胞分离液： Ficoll-hypaque密度梯度离心法 Percoll不连续密度梯度法,单核细胞分离,玻璃或塑料皿的粘附贴壁法吞噬羰基铁颗粒磁铁吸附法,T、B淋巴细胞分离,1、E花环法分离T淋巴细胞淋巴细胞悬液SRBC 370C 1-2小时 或40C过夜 密度离心 T淋巴细胞,T、B淋巴细胞分离（续）,2、尼龙纤维粘附法分离B淋巴细胞3、免疫吸附法 抗人Ig包被平皿 吸附SmIg阳性的BL4、免疫磁性微珠分离法 （Immunomagnetic beads,IMB) 用包被用抗体或抗原的可磁化颗粒（Fe3O4 + 大分子材料）作为免疫反应的载体，快速高效的分离，无需离心沉淀分离技术；,5、荧光激活细胞分离仪分离法,流式细胞术（Flow cytometry , FCM） 将光学流体力学、电子学和计算机等多种技术综合为一体， 对单个细胞进行快速、灵敏、多参数的定量测定，并进行综合分析的一项技术。荧光激活细胞分离器（Fluorescence activated cell sorter, FACS ）,荧光激活细胞分离器,组成：气控单细胞层流系统激光光源系统光检测及信息处理系统细胞分离纯化系统,荧光激活细胞分离器,主要原理： 将细胞悬液与标有荧光素的单克隆抗体反应。细胞经喷嘴流出，每一微滴只含一个细胞。微滴经过检测器时，检测器根据激光束的散射，判断每滴是否含有细胞。借助光电效应，微滴通过电场时，可出现不同偏向。利用不同波长的荧光素标记的单克隆抗体染色，能同时分析细胞表面 的23种表面标志，因此可以收集所需类型的细胞，并以数字显示细胞数量。,荧光激活细胞分离器,应用：测定细胞表面特性细胞体积大小分析细胞DNA、RNA含量分析细胞内某种蛋白质的含量免疫学方面的具体应用：分析和分类 细胞亚群分离各类 细胞分离活细胞和死细胞用微量板代替收集管来克隆单个细胞分析细胞周期动力学检测稀有的细胞,6、免疫磁株分离法,二、细胞免疫的体外检测法, 免疫细胞总数检测法 1、免疫细胞表面抗原鉴定 微量间接免疫荧光法 金黄色葡萄球菌 花环法 微量细胞毒法 CD3细胞 7080% （CD4细胞CD8细胞CD3细胞） CD4细胞 / CD8细胞2：12、E花环法（T细胞总数检测）,3、T细胞总数测定： 醋酸萘酯酶（ANAE）染色法,醋酸萘酯酶醋酸萘酯 醋酸萘酚 Ph 7 偶氮副品红 偶氮副品红萘酚 （不溶性）ANAE细胞68.111.4%,B淋巴细胞检测法,1、EA花环试验：2030%2、EAC花环： 1320%3、SmIg检测法：1234%,淋巴细胞体外增殖试验,1、淋巴细胞转化试验 形态学方法：淋巴母细胞计数 3H胸腺嘧啶核苷 掺入法 MTT检测法： 线粒体脱氢酶 四甲基偶氮唑蓝 蓝黑色甲潜 活细胞 （MTT） （formazan） 570nm测吸光值,促分裂原 缩写 T细胞 B细胞植物血凝素 PHA + 刀豆蛋白A CONA 葡萄球菌A蛋白 SPA 美洲商陆 PWM 细菌脂多糖 LPS EBV - +结核杆菌纯化蛋白衍生物 PPD 细菌类毒素 组织抗原：HLA 肿瘤抗原 抗淋巴细胞血清 ,2、混合淋巴细胞培养（Mixed lymphocyte culture,MLC),细胞毒性试验,1、抗体依赖性细胞介导的细胞毒试验 （ADCC）2、NK细胞活性检测：靶细胞K562、YAC-13、细胞毒性T 细胞活性检测（CTL、LAK 、TIL） 检测方法：同位素释放法 Na51CrO4 酶释放法（LDH）溶解百分率 （实验组CPM-自发释放组CPM） 100% （最大释放组CPM-自发释放组CPM）,抗体形成B淋巴细胞数量测定,空斑形成细胞测定（Plaque forming cell,PFC）定量溶血分光光度法,红细胞免疫功能测定法,红细胞-酵母花环试验 : 测定红细胞膜C3b受体活性 (1318%)红细胞免疫复合物花结试验: 红细胞粘附免疫复合物 (46%) 原理: 激活补体吸附C3b受体 致敏酵母菌酵母菌 暴露表面多糖 吸附RBC粘附IC- C3b中的C3b放射免疫测定: 抗人C3b受体单抗,第四节 免疫分子的检测,1、补体测定 血清总补体活性测定：SRBC （CH50单位/ml) 补体旁路途径活性测定 补体组分测定2、免疫球蛋白测定3、免疫复合物检测：PEG沉淀法 分子受体法（SPA） 细胞受体法（Raji细胞）,4、细胞因子检测,检测方法： 生物活性检测法: 优点: 敏感性较高,特异性较强, 稳定性较好,所检测的是具有生物活性的细胞因子。 缺点：细胞培养过程受许多因素影响，影响细胞因子的实际含量。 免疫学检测法：ELISA、RIA 分子杂交法：PCR、Northern印迹法、原位杂交检测细胞因子的mRNA, 干扰素的测定,细胞病变抑制法:IFN + 病毒的靶细胞 + 攻击病毒 50%细胞不出现细胞 病变的标本稀释度为IFN 的效价Wish（人羊膜）细胞VSV（水泡口炎病毒）微量细胞病变抑制法 IFN、与IFN的鉴别 IFN、 IFNpH2.0处理18小时 稳定 不稳定56。C处理1小时 稳定 不稳定抗IFN抗体中和试验 中和 不被中和抗IFN抗体中和试验 不被中和 中和,白细胞介素的检测,IL-1的检测： 胸腺细胞增殖试验： 3H-TdR IL-1C3H/HeJ小鼠胸腺细胞 细胞增殖（cpm） 纤维母细胞增殖试验： 3H-TdR IL-1 + L929小鼠纤维母细胞 细胞增（CPM） 热源检查试验：家兔耳源静脉注射,白细胞介素-2的检测,IL-2依赖T细胞株的增殖试验: 3H-TdR IL-2 + CTLL-2 细胞 测定CPM值活化淋巴细胞增殖试验: ConA BALB/c小鼠脾细胞 淋巴母细胞 3H-TdR IL-2 + 淋巴母细胞 测定CPM值,IL-4的检测,B细胞增殖试验: BALB/c小鼠脾细胞 去除TL ,得BL 3H-TdR IL-4 + B 淋巴细胞 测定CPM值ELISA检测:,IL-6的检测,IL-6依赖细胞株增殖试验: 3H-TdR IL-6 + IL-6依赖细胞株(B9) 测定CPMELISA法：,TNF的检测,抗瘤细胞毒性试验: 染色鉴定细胞活性TNF + 肿瘤细胞株(L929) MTT试验 L929细胞 株：小鼠成纤维细胞系 L-M细胞系：（ATCC-CLL1.2） EMT-6：小鼠乳腺癌细胞系 WEHI-164克隆13：小鼠纤维肉瘤细胞系,集落刺激因子的检测,CSFS依赖细胞株增殖试验: 3H-TdR GM-CSF + DA3.15髓性细胞系 CPM 3H-TdR M-CSF + M14髓性细胞系 CPM 3H-TdR G-CSF + NES60.4髓性细胞系 CPM,4.细胞