免疫组化

1,免 疫 组 织 化 学 技 术,2,概 述 免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，是应用免疫学及组织化学的原理，对组织切片中的某些化学成分进行原位显示的技术。,Immunohistochemistry,概 述,1.概念,3,采用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测，检测相应的目的抗原（或抗体）,并进行定位、定性和定量分析。 实际上该法是以免疫学方法取代化学方法的一种特殊的组织化学染色技术。,概 述,4,它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。,概 述,5,2发展简史 1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。建立免疫荧光技术。 60年代 Nakane铁蛋白标记Ab,用酶代替荧光素来标记抗体的方法 建立酶标抗体技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术建立辣根过氧化物酶-抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。当今使用最为广泛 1975年建立单克隆抗体技术。,概 述,6,80年代 Hsu 等建立了抗生物素-生物素（ABC）法之后，免疫金-银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。,概 述,7,适用于蛋白水平上组织的抗原或抗体检测。 凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。 最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，进而深入研究其功能。,概 述,3.免疫组织化学的临床应用：,8,主要用于常规石蜡切片难以完成的疑难肿瘤的诊断 （1）对肿瘤的组织起源进行鉴别诊断，确定转移性恶性肿瘤的原发部位 （2）对肿瘤的良恶性进行综合判断 （3）对肿瘤进行进一步的病理分型和分期 （4）发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定， 包括手术范围的确定（5）为临床提供治疗方案的选择 （6）癌基因蛋白、肿瘤激素受体及生长因子的检测对肿瘤预后的判断 （7）癌基因蛋白检测可用于肿瘤病因及发病机理的研究,概 述,3.免疫组织化学的临床应用：,9,概 述,组织标本：包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片细胞标本：包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片,4. 免疫组化实验所采用的组织和细胞标本,10,概 述,其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，能作连续切片，有利于组织多种染色对照观察；细胞层次感好，组织形态完美；且可以在室温存放，能长期保存完好的组织形态，长期存档，供回顾性研究；可以切到4m左右，使得原位杂交探针容易渗透到组织中去；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。,11,概 述,冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。 缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮 ；为了防止RNA降解，要保存在-80的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，更要注意。,12,概 述,单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。,5.免疫组化实验所用的抗体有：,13,概 述,病理诊断中常用抗体的选择 ： 根据抗体在免疫组化病理诊断应用中使用的频度及作用可分为一线、二线和三线抗体。临床病理诊断最常用的抗体如下所述，其中一线十大抗体为细胞角蛋白(CK)、波形蛋白(Vimentin)、肌动蛋白(Actin)、血管源性细胞标记抗体(CD31)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、白细胞共同抗原(LCA)、癌胚抗原(CEA)、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)。,14,概 述,病理诊断中常用抗体的选择：(1)上皮性细胞标记抗体(2)间叶性细胞标记抗体 (3)肌源性细胞标记抗体(4)血管源性细胞标记抗体(CD31) (5)神经内分泌细胞标记抗体(6)神经外胚叶细胞标记抗体(7)淋巴组织细胞标记抗体(8)肿瘤相关抗原标记抗体(9)激素受体抗原标记抗体,15,6. 免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.观察结果。,概 述,16,7免疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式分为： 贴片染色 漂浮染色,概 述,17,7免疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式（2）根据Ag-Ab结合方式分为： 直接法 间接法 多层法,概 述,18,7免疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式分（2）根据AgAb结合方式分（3）按标记物的性质分为： 免疫荧光技术（免疫荧光法） 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、 ABC法） 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法） 放射免疫自影法,概 述,19,免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。,概 述,20,8标记物（1）必要性：组织细胞内Ag-Ab结合后形成的“免疫复合物”在一般光学条件下是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。 因此先在已知抗体(或抗原)上连接一些可以用光镜观察到的显示剂，经过特定化学反应，最后“免疫复合物”显示不同颜色。在普通显微镜、荧光显微镜下能通过观察组织细胞特定部位颜色变化来找出疾病的特征性表现。,概 述,21,8标记物（1） 必要性（2）常用标记物 荧光素：,概 述,免疫荧光法的基本原理是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。,22,8标记物（1） 必要性（2）常用标记物 荧光素,概 述,异硫氰酸荧光素（fluorecein isothiocyante，FITC），为黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，易溶于水和酒精等溶剂。荧光显微镜下呈明亮的黄绿色荧光。四甲基异氰酸罗达明（tetrametrylrhodarnine isothiocyante，TRITC）为紫红色粉末，较稳定，荧光显微镜下呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明，常用于双标记染色。,常用的有：,23,8标记物（1） 必要性（2）常用标记物 荧光素 酶,概 述,免疫酶法是借助酶细胞化学等手段显示组织抗原（或抗体）的技术，是在免疫荧光法的基础上发展起来的。将酶以共价键的形式结合在抗体上，制成酶标抗体，再借助酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面或细胞内部各种抗原成分的定位。,24,概 述,免疫酶法与免疫荧光法相比较，具有以下优点：酶反应产物呈现的颜色不仅能在一般的普通生物显微镜下观察，而且其产物因具有一定的电子密度也可在电镜下观察（免疫电镜技术），光镜与电镜的结合，使灵敏度进一步提高，标本又能长期保存，并能加设HE染色等其他复染，有利于将被检测物质与病变的形态学改变联系起来（定性与定位），弥补了免疫荧光法的不足。,25,8标记物（1） 必要性（2）常用标记物 荧光素 酶,概 述,辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）是由无色酶蛋白和深棕色的铁叶结合组成的一种糖蛋白，分子量为 40，000道尔顿，等电点39，最适 PH为 5.0左右。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）是一种磷酸酶的水解酶，在人体或动物组织中分布广泛，如肝、胎盘、白细胞、肾、小肠等。分子量为80KD，最适PH为9.8，其活性受底物及浓度、缓冲液及其离子浓度等因素影响。葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）等，但因其形成的不溶性色素扩散作用较大，在应用上受到很大限制。,常用的有：,26,8标记物（1） 必要性（2）常用标记物 荧光素 酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶 ） 生物素（Biotin）,概 述,为一种较小分子量的含硫水溶性维生素，其分子量约为244，它与卵白素之间具有极强的亲和力，较之抗原与抗体的亲和力高出100万倍，能够彼此牢固地结合而不影响彼此的生物学活性。,27,8标记物（1） 必要性（2）常用标记物 荧光素 酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶 ） 生物素（Biotin） 铁蛋白金（主要应用于免疫电镜 ） 其他：如同位素（因涉及污染和防护困难,一般不用）,概 述,28,9.全自动免疫组织化学染色仪,概 述,29,1、谈谈免疫组化应用的临床意义。2、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些?这些标本各具有哪些优缺点？,思考题：,30,免疫组化技术,31,1.免疫组化所需仪器设备,仪器设备,32,PBS（磷酸盐）缓冲液0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液3%过氧化氢溶液DAB显色系统0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）1mol/L的TBS缓冲液酶消化液3%甲醇-H2O2溶液封裱剂 TBS/PBS,2.免疫组化所需试剂,所需试剂,33,PBS（磷酸盐）缓冲液（pH7.27.4）：,2.免疫组化所需试剂,所需试剂,NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。,或PBS粉剂加dd水配制0.01mol pH7.27.4的缓冲液,34,0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液,2.免疫组化所需试剂,所需试剂,（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。,或PBS粉剂加dd水配制0.01mol pH6.0的缓冲液,35,3%过氧化氢溶液,2.免疫组化所需试剂,所需试剂,用30%H2O2和去离子水配制。,36,DAB显色系统：,2.免疫组化所需试剂,所需试剂,DAB及DAB稀释液配制1ml稀释液内加入一滴DAB,37,0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：,2.免疫组化所需试剂,所需试剂,700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。,38,1mol/L的TBS缓冲液,2.免疫组化所需试剂,所需试剂,在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。,39,酶消化液,2.免疫组化所需试剂,所需试剂,a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。,40,3%甲醇-H2O2溶液,2.免疫组化所需试剂,所需试剂,用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。,41,封裱剂,2.免疫组化所需试剂,所需试剂,a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合； b、油和TBS(或PBS)配制。,42,TBS/PBS,2.免疫组化所需试剂,所需试剂,pH9.09.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.07.4，适合于光学显微镜标本。,43,3.组织的前期处理,前期处理,固定烤片,44,前期处理,固 定,45,固 定,前期处理,固定时间对染色的影响,46,固 定,前期处理,固定时间的影响,中性福尔马林固定72小时,中性福尔马林固定48小时,47,前期处理,甲醛与氨基酸在组织上产生交联。,固 定,48,前期处理,固 定,49,取材后组织（1.01.40.4cm）推荐固定时间418小时。 固定时间较长的标本，可通过加强修复增强染色效果。,前期处理,固 定,50,取材后组织（1.01.40.4cm）推荐固定时间418小时。,前期处理,固 定,经常影响到免疫组化染色和诊断的因素是组织固定不够。由于组织固定不够，造成组织和细胞收缩、染色不着色或出现非特异性染色，难以做出正确判断 。,51,前期处理,固 定,组织固定不够,组织固定不够造成HE和免疫组化染色只有周边着色,固定好部分染色理想；深部组织没有被固定，不着色；交界处固定不理想，仅有部分细胞着色。,52,前期处理,固 定,组织固定不够的原因分析 ：,固定时间不够,10福尔马林的渗透速度大约是4小时2.7mm，随着时间延长速度会逐渐减慢。也就是说5mm厚的组织，固定时间大约要4小时才够。增加浓度反而会降低渗透速度。,53,前期处理,固 定,组织固定不够的原因分析 ：,固定时间不够固定液浓度不够固定液用量不够,病理规范中：固定液的用量是标本体积的610倍。内镜活检、骨穿等小标本容易达到这个标准。,54,前期处理,固 定,组织固定不够的原因分析 ：,固定时间不够固定液浓度不够固定液用量不够大标本或有包膜的组织不切开固定,大标本需要切开，保证里面的组织固定。淋巴结需要切开包膜以利于固定液的渗透。,55,固定时间较长的标本，可通过加强修复增强染色效果。,前期处理,固 定,56,前期处理,烤 片,烤片的温度不宜过高烤片的时间不宜过长,烤片温度过高不仅会引起切片细胞收缩，而且对组织内抗原的保存有一定的影响，尤其是细胞核阳性的抗原；但时间太短(少于20分钟)，容易造成脱片。推荐烤片温度及时间5060 ，烤24小时。有人主张60烤0.51小时左右即可。,57,脱蜡和水化抗原修复免疫组织化学染色,4.免疫组化操作流程,操作流程,58,前期处理,脱 蜡,凡是石蜡切片必须经过二甲苯脱蜡，各级乙醇至水洗的过程。（切片脱蜡、二甲苯、各5min10min 95%乙醇各5min75%乙醇 5min 自来洗水冲）二甲苯和各级乙醇必须保持一定纯度，不能混入其他杂质成分，而使染色受到影响。,59,前期处理,脱 蜡,组织切片的脱蜡步骤应彻底，否则无论进行哪种染色都会发生困难。脱蜡时间要充分，若溶蜡剂使用过久应及时更换以免效率降低，若室温过低，可将溶蜡剂置于温箱中进行脱蜡。,60,前期处理,脱 蜡,脱蜡不充分，切片不易着色或着色不匀，造成花斑。,61,脱蜡和水化抗原修复免疫组织化学染色,4.免疫组化操作流程,操作流程,62,抗原修复,抗原性主要由分布在抗原表面的抗原决定簇决定。,组织固定、脱水、透明、浸蜡、烤片，阻断剂H2O2、甲醇、抗原暴露及修复过程中用的蛋白酶、酸、缓冲液等各种理化因素，都会使抗原受到影响，导致抗原决定簇不同程度的破坏甚至完全破坏，丧失原有的抗原性。,63,固定不足，使组织中心部位的一些抗原溶解、弥散、丢失；固定时间或浸泡在固定液中过久导致抗原性降低，固定时间越长，抗原被掩盖的程度越重，免疫组化染色结果越差；固定液的种类、浓度对抗原性的影响，甲醛、醇类等不同种类的固定液对不同抗原的固定效果不同。,组织固定对抗原性的影响主要表现为：,抗原修复,64,例如石蜡切片标本用甲醛固定后，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。,抗原修复,65,因此，需要进行免疫组化标记的材料，从取材制片到染色全过程都应尽量减少人为因素对抗原性的不良影响。,抗原修复,66,抗原修复是指石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活性剂或微波、金属盐等对被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原进行暴露和修复，使抗原性得到一定程度恢复的过程。抗原修复有利于抗原抗体结合，提高阳性检测率。,抗原修复,67,自从应用抗原修复技术的文章于1991年发表后，抗原修复技术（煮沸石蜡切片于水溶液中）迅速、广泛应用于常规甲醛固定、石蜡包埋组织切片的免疫组织化学染色，从而打开了从传统形态学迈向分子形态学的大门。抗原修复技术被誉为免疫组织化学技术的革命性突破。Gown在评价抗原修复技术所取得的成就时，指出“在过去十多年里，抗原修复技术在诊断性免疫组织化学分析方面造成了如此深远的影响，使得这方面的文献分为2个时代：抗原修复技术前与抗原修复技术后时代。20世纪90年代初抗原修复技术的问世就是这两个阶段的分水岭”。抗原修复是免疫组化发展史上一个里程碑。,抗原修复,68,抗原修复,69,温度和时间的相关性修复液的PH值亦很重要 8-9,抗原修复的主要影响因素：,抗原修复,70,抗原修复的有效性=加热温度（T）加热时间（t）,高温可以缩短修复时间低温需要更长的修复时间某些蛋白（抗原）需要较低温度修复,抗原热修复温度和时间的关系,达到10015min-20min,抗原修复,71,pH值对抗原修复有