免疫组化新

张 煦,免疫组化技术及其在肿瘤病理诊断中的应用,兰州大学基础医学院病理学研究所,2011.10,第一部分免疫组化技术（Immunohistochemistry techniques）,一定义： 是应用抗原与相应抗体接触后可形成抗原抗体复合物的化学反应，以检测组织或细胞内抗原或抗体的技术。1、免疫组化与组织化学（histochemistry）2、免疫组化与亲合组织化学（affinity histochemistry）3、免疫组化与免疫病理（immunologic pathology）4、免疫细胞化学与原位杂交免疫细胞化学（In situ hybridization immunocytochemistry）,图,免疫组化与组织化学,免疫组化是组织化学的一个分支。组织化学是在细胞和组织中以化学和物理的实验方法对某些特殊物质、反应基因和酶促活性进行识别、定位和定量。即组织化学技术是通过分解、置换、氧化、还原等化学变化，经呈色反应显示组织细胞内的化学成分的方法。免疫组化则是利用免疫学的抗原、抗体具有特异性结合的原理，检测组织细胞中的化学成分或化学性质。,组织化学与免疫组化的区别 组织化学显示各种不同的化学成分往往需要用各种不同的方法和条件，既烦琐又不甚敏感，有很大的局限性。而免疫组化则不然，虽然程序繁杂，但用一种基本方法能够检测定位许多组织成分，如：各种蛋白质、多肽、酶、激素，甚至多糖和脂质成分等都可以用免疫组化方法进行检测。,免疫组化与亲合组织化学（affinity histochemistry）,近20多年来，相继发现了多种亲合物质，如：植物凝集素（Lectins）与糖结合物（glycol conjugates）、葡萄球菌A蛋白（staphylococal proteinA）与IgG、生物素（biotin）与卵白素（avidin）、激素（脂质）与受体等。这些物质是一些有双价或多价结合能力的物质，不但亲合物质之间有高度亲合力，而且可以与标记物如：荧光素、酶、同位素、铁蛋白等相结合。,Bayer（1976）将这种利用两种物质之间的高度亲合力的进行的组织化学检测称为亲合组织化学。虽有人认为它们是免疫组化的进一步发展，但亲合物质之间的反应并不是抗原与抗体的反应。从抗原与抗体互相亲合来看，免疫组化倒应包括在亲合组织化学之中。随着亲合组织化学的发展，一些亲合物质又被引入免疫组化，使两种组织化学技术融合为一种方法，明显提高了组织化学定位的准确性和敏感性。,免疫组化与免疫病理（immunologic pathology）,目前，许多人把免疫组化和免疫病理等同起来，认为免疫组化就是免疫病理，实际上二者是有区别的。狭义的免疫病理学是指研究异常的免疫反应，如变态反应所引起的疾病的病理，也包括自身免疫病和免疫缺陷。,广义的免疫病理学则研究所有疾病及病变发展中的免疫学机理问题。免疫病理的研究中，免疫组化技术的确占重要位置，它可以确定组织内抗体、补体、抗原，并识别淋巴细胞亚群，但免疫病理的研究方法还包括其他免疫学方法及一些非免疫学方法。另一方面，免疫组化可以识别与免疫病理无关的其他许多抗原，如：病毒、酶、激素等。可见免疫组化与免疫病理既有密切联系，又有明显区别，既有交叉又有独立的内容。,免疫细胞化学与原位杂交免疫细胞化学（In situ hybridization immunocytochemistry）,原位分子杂交技术引入免疫细胞化学，是现代免疫细胞化学向基因水平深入发展的重要标志。近年来，分子杂交与免疫细胞化学的结合日益紧密，尤其是在杂交后信号的检测技术，引入免疫细胞化学和免疫放大和显色技术，从而形成杂交免疫组织化学或称原位杂交免疫组织化学，成为免疫组织化学中又一新的分支。,分子杂交与免疫组织化学的结合，形成了在细胞、亚细胞和分子水平同时检测基因及其表达产物的完整体系，把基因探针（基因工程）和单克隆抗体技术结合起来，成为当代生物科学和医学在分子水平研究和诊断的新兴技术。尤其是近年来与PCR技术结合的原位PCR技术，敏感性很高，包括分子生物学基础理论、核酸分子探针制备、原位分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）、核酸分子杂交电镜技术、杂交与免疫细胞化学双标记技术、分子杂交在染色体制片的应用和分子杂交基因诊断的应用等方面。,二免疫组化技术发展史,1、1941年，Coons等人首次用荧光素标记肺炎双球菌粘多糖抗体，检测小鼠组织内的肺炎双球菌获得成功，从而开创了免疫荧光组织化学技术，并逐渐在生物学和医学中推广应用。因此，目前一致公认A.H.Coons是免疫细胞化学的创始人。,2、1966年，Nakane和Pierce用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）替代荧光标记抗体，在次基础上建立了酶标抗体技术。3、1970年，Sternberger又改良酶标抗体技术，建立了PAP法（peroxidose-antiperoxidase method）。4、1981年，许世明创立ABC法（avidin-biotin peroxidase complex mothod）比PAP法灵敏2040倍。,5、Kohler and Milstein于1975年创立了McAb技术，较PcAb的抗原性强，进一步提高了免疫组化水平。6、继ABC法之后，免疫金银染色法，半抗原标记法和集合免疫细胞化学技术等又相继问世，免疫电镜技术继而迅速发展。特别是近年来，大量即用型McAb和PcAb的不断问世和商品化，为免疫组化技术的推广和普及奠定了基础，并使实验向临床，向定量和分子水平深入。,三 免疫组化技术的特点,1、高度的特异性、可达到单个AA水平。2、敏感性高。3、方法、步骤统一。4、形态、机能、代谢的完美结合（定性、定位、定量）。,四 病理诊断准确率,HE水平：8590%HE + 免疫组化：95%HE + 免疫组化 + 分子生物学：98%,五 免疫组化技术全过程,1、抗原提取（纯化）（粉碎、沉淀、层析、离心、电泳）2、抗体制备：,用Ag免疫动物产生Ab，由于Ag有多个决定簇，刺激多个B细胞克隆，产生针对多个Ag决定簇的混合物（多价Ab）。,用杂交瘤技术，在细胞培养条件下，经过多次克隆化，使一个杂交细胞及其后代产生一种均质的Ab。（分离出单个细胞，使其通过分裂增殖而获得一个遗传特性）,3、抗体纯化：除去抗血清中的其他白蛋白，、球蛋白以及纤维蛋白。（目的：Ab标记时，免受其他蛋白的干扰）4、标记抗体：Marrack于1934年提出了在Ab分子上结合适当的标记物，用以识别其相应抗原的设想。,Marker种类：荧光色素、酶、金、铁蛋白、放射性同位素、血浆蛋白、多聚微球蛋白、RBC、 病毒、噬菌体。,5、细胞和组织切片标本的制备。6、免疫组化反应和显色。7、观察和分析结果。,六 ABC法和PAP法免疫酶标记步骤,1、石蜡切片，二甲苯脱蜡三次。2、经100%、95%、80%酒精、蒸馏水水化。3、阻断内源性HRP：0.3%H202甲醇液，室温20分钟，PBS冲洗3x5。4、蛋白液消化：0.05%胰蛋白酶，室温30，PBS冲洗3x5。5、保护：正常马、牛血清（13%），室温20，勿洗。,6、滴加抗，置湿盒内，4冰箱过夜。7、PBS液洗3x5。8、滴加抗，湿盒内室温30，PBS 洗3x5。9、滴加PAP或ABC试剂，室温30，PBS洗3x5。10、显色：DAB液5 15，镜下控制，PBS冲洗。11、复染：苏木素12分钟，盐酸酒精分化30秒，兰化10。12、80%、95%、100%酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。,七 关于标记的几点说明,1、阻断2、消化3、保护4、抗体5、显色原理：HRP+H2O2 HRPH2O2 HRPH2O2+DH2 HRP+D+2H2O6、镜下控制,八 显色观察,1、阳性细胞数2、阳性反应强度 3、表达型4、阳性分级5、必须设对照6、假阳性反应7、假阴性反应,1.非特异性反应： 边缘现象、 皱褶和刀痕、“沙 丘”效应、出血和坏死、组织积压、被动吸收或主动吞噬2.内源性过氧化物酶3.抗体的交叉反应4.试剂浓度过高或失效,1.固定不当或固定时间过长2.抗体效价过低3.其他试剂久置4.切片过薄或过厚5.组织储存过久6.组织中抗体被粘稠基质、分泌物或多层细胞膜阻隔,下一页,常用的上皮性标记物,1.角蛋白（Keratin,KER;Cytokeratin,CK ）2.上皮（细胞）膜抗原（Epithelial membrane antigen,EMA）3.癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen,CEA）4.包壳蛋白（Involucrin）5.桥粒蛋白（Desmosomal proteins）,常用间叶性标记物,1.所有间充质细胞 波形蛋白（Vimentin,VIM）2.内皮细胞 第八因子相关抗原（Factor related antigen,F- Rag,F8） 荆豆凝集素（Ulex europaeus lectin,REA-1）3.组织细胞 溶菌酶（Lysozyme,muramidase,LYS） 1- 抗胰蛋白酶（1-antitrupsin,AAT） 1- 抗糜蛋白酶（1 antichumotruosin,AACT）,间叶组织间质标记物,1.纤维连结蛋白（Fibronectin,FN）2.基板蛋白（Laminin）3.骨连结蛋白（Osteonectin,ON）4.、和型胶原（Collagen、 ）,肌肉组织标记物1.结蛋白（Desmin,DMS）2.肌动蛋白（Actin）3.肌球蛋白（Myosin）4.肌红蛋白（Myoglobin,MG）5. 肌酐激酶BB和MM（Creatinine kinase BB&MM）6.Z-蛋白（Z-protein）,淋巴造血组织标记物,1.白细胞共同抗原（Leucocyte common antigen,LCA,CD45）；2.免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）轻链（、）重链（、）；3.全B细胞单克隆抗体：CD19（B4）、CD20（B1）、CD22（Leu14）、L26；4.全T细胞单克隆抗体：CD2（OKT11,Leu5）、CD3（OLT3,Leu4）、CD5（OKT1,Leu1）、CD7（Leu9）、UCHL1;,淋巴造血组织标记物,5.T细胞亚群单克隆抗体：CD4（OKT4,Leu3）、CD8（OKT8,Leu2）;6.单核-巨噬细胞抗体：MAC387,LYS;7.其他：TdT、CD10（CALLA）、CD15（Leu M1）、CD30（Ki-1，Ber H2）、HLA-DR、Leu7。,干细胞,前B细胞,B1,中心母细胞,中心细胞,边缘带细胞,B2,浆细胞,免疫母细胞,浆样细胞,骨髓,淋巴结,B细胞的发育转化示意图,B1：套细胞B2：记忆细胞,抗原刺激,活化的淋巴样母细胞,滤泡母细胞,T细胞的分化演变过程,T1,免疫母细胞,T2,骨髓,胸腺,外周淋巴组织及血液,NK（细胞毒）,曲核细胞,抗原,抗原,T-LBL/T-ALL母细胞NK淋巴瘤,肝脾T细胞T-PLL/T-CLL,细胞毒： 皮下脂膜炎样、肠病型、T-LGL、ALCL（皮）、 ALCL（系统）、（肝脾T）NK细胞：侵袭性NK白血病、NK/T鼻型、（母细胞NK淋巴瘤）T细胞： 非特殊类型外周T、成人T、蕈样霉菌病、 血管免疫母细胞、（T-PLL/T-CLL）,细胞毒、抑制、辅助,小细胞淋巴瘤的典型免疫表型,中枢和周围神经标记物,1.胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acdic protein,GFAP）；2.神经微丝蛋白（Neurofilament proteins,NFP）；3.S100蛋白（S100 protein, S100）；4.髓磷脂碱性蛋白（Myelin basic protein,MBP）；5.Leu7；6.神经元特异性烯醇化酶（Neuron specific enolase,NSE）。,神经内分泌细胞一般性标记物,1.神经原特异性烯醇化酶（NSE）2.嗜铬颗粒蛋白（Chromogranin A,CHG-A）3.嗜铬颗粒膜蛋白（Chromomembrin B,CHM-B）4.突触囊泡蛋白（Synaptophysin,SY ）5.Leu7,激素标记物,1.垂体激素：促肾上腺皮质素（ACTH）、生长素（GH）、泌乳素（LTH）、促甲状腺素（TSH）、促卵泡成熟素（FSH）、黄体生成素（LH）2.胰岛细胞、胃肠道和呼吸道激素：胰岛素（Insulin）、胰高血糖素（Glucagon）、胰多肽（Pancreatic polypeptide,PP）、生长抑素（Somatostatin）、胃泌素（Gastrin）、血管活性肠多肽（Vasoactive intestinal peptide,VIP）、5-羟色胺（Serotonin）、蛙皮素（Bombesin）、降钙素（Calcitonin）和ACTH等3.其他：甲状腺素（T3、T4）、肾上腺素和去甲肾上腺素、绒毛膜促性腺激素（hCG）。,器官特异性抗原的标记物1.前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen,PSA）2.前列腺酸性磷酸酶（Prostate acid phosphatase,PAP）3.甲状腺球蛋白（Thyroglobulin,TGB）4.乳酪蛋白（Casein）5.乳白蛋白（Lactalbumin）6.胰淀粉酶（Pancreatic amylase）,瘤胚性抗原标记物,1.癌胚抗原（CEA）2.甲胎蛋白（1-fetoprotein,AFP）,即用型抗体和S-P试剂盒的商品化，方便了基层，使得推广应用免疫组化技术成为可能。由于发展的不平衡