《蛋白质电泳技术》PPT课件

电泳技术,段天璇,一、基本理论,1.常用公式和术语E=U/L电场强度(V/cm)=电压(V)/电极间距(cm)*相对迁移率mR=蛋白质迁移距离/示踪染料迁移距离ep=v/E=l/(tE)=lL/(tU)=q/(6r)(cm2/(s*V)F=qE=F=6rvl：蛋白质迁移距离电泳速度v=epE=epJ/K分离度,影响电泳的环境因素,电泳速度v=epE=E/(C)C:6or4EpH:pI(4-7),缓冲溶液pH(8-9.5),向？极泳动离子强度I:0.02-0.2电渗温度：焦耳热介质：孔径、制胶重复性等,2.分类,按原理:区带电泳,(移界电泳),稳态电泳,显微电泳,3.电泳仪及附属设备,提供稳定直流电源的装置电压、电流、电功率稳定脉冲式电压常压电泳仪(600V):净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳高压电泳仪(3kV):载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序超高压电泳(30-50kV):毛细管电泳,电泳槽板状电泳槽水平板垂直板管状电泳槽*自由界面电泳槽,DYCP-33A型琼脂糖水平电泳仪(槽)(中号),DYCZ-22B型单垂直电泳仪(槽)（大号）,4.电泳的支持介质,特性（要求）物理化学性质稳定化学惰性均匀种类,5.检测-染色方法,考马斯亮蓝：常用荧光染料：灵敏硝酸银：灵敏酶活性免疫学：专一特殊蛋白质糖蛋白、脂蛋白、铁蛋白、铜蛋白,三苯基甲烷衍生物，-SO3-蛋白质的碱性基团染料-蛋白质复合物。R型G型二甲花青亮蓝-甲基取代的三苯基甲烷衍生物染色固定蛋白质-染色-脱色同时固定和染色-脱色脱色30%甲醇的10%乙酸溶液等,二、琼脂糖凝胶电泳agarosegelelectrophoresis,支持介质：琼脂糖结构：1,3连接的-D半乳糖和1,4连接的3,6脱水-D半乳糖线性联结成琼脂糖，琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成交联结构特点：大孔胶，适于核酸、线性DNA,RNA分离分析分离原理：0.2-50kb操作形式：水平电泳、免疫电泳、平板等电聚焦,Agarose,D-galactose,3,6-anhydroL-galactose,性能指标电内渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度、脱水收缩作用纯度：硫酸根含量少，纯度高应用：核酸研究,不同浓度凝胶分离200bp-50kbDNA检测：荧光染料溴乙啶，电泳后染色操作过程：见AgaroseGelElectrophoresis.ppt,三、醋酸纤维素薄膜celluloseacetatefilm,纤维素-乙酰化特点定量准确性提高：吸附少、染色背景脱色较快速：电渗小灵敏度高，样品用量少：5微克蛋白质薄膜可保存操作简单快速价廉应用领域：血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、脱氢酶、多肽等,四、聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE,以polyacrylamidegel为分离介质分离原理：电荷密度+分子筛特点应用领域操作形式(圆盘电泳)垂直板电泳水平板电泳,1.聚丙烯酰胺凝胶polyacrylamidegel,PAG,聚合化学聚合光聚合总浓度与交联度,单体交联剂催化剂丙烯酰胺+N,N-亚甲基双丙烯酰胺PAGAcrBis加速剂,总浓度与交联度的影响,凝胶浓度T=(a+b)/m100%(g/mL)交联度C=b/(a+b)100%a=mAcr;b=mBis;m=Va/b：凝胶性状、孔径、分子筛效应等C=6.5-0.3T浓度筛选：标准凝胶T=7.5%或梯度胶,凝胶孔径,2.连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(1959),凝胶孔径、缓冲液（样品、凝胶、电极）不变分离原理：样品电荷特点：制胶简单、条件简单恒定、分辨率不高适用：简单样品,3.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,含义：不同胶孔径、不同缓冲液分离原理：电荷效应+分子筛效应特点：样品成分浓缩-分离，分辨率高；操作复杂适用：广泛应用的主要电泳技术3种物理效应样品浓缩；分子筛效应；电荷效应,不连续性凝胶浓度：浓缩胶-分离胶缓冲液离子成分缓冲液pH电位梯度,制胶,分离胶,样品胶浓缩胶,4.SDS-PAGE,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离原理:分子筛-分子相对分子质量蛋白质-SDS复合物呈棒状且大量带电(-),消除样品蛋白质分子间电荷差异应用：蛋白质纯度检测和相对分子量测定操作形式：多用垂直管或垂直板，不连续系统，或梯度胶,SDS-PAGE,操作特点样品:制胶：缓冲液：分离、浓缩胶缓冲液均含SDS等分子量的确定染色考马斯亮蓝-蛋白质吸附量-近似Beer定律其他染色计算标准蛋白质mR，作lgMr-mR标准曲线待测蛋白mR-Mr,同时测定,5.梯度凝胶电泳,分离胶浓度为线性或指数梯度分离原理：蛋白质分子大小T4-30%,Mr5万-200万，分辨较小Mr差异可不与SDS反应，与SDS-PAGE互补常加入SDS制胶：梯度混合器,五、等电聚焦电泳isoelectricfocusingIEF,分离原理：利用pH梯度的介质分离pI不同的蛋白质分辨率pI相差0.01-0.001适用研究蛋白质微观不均一性测定蛋白质等电点操作形式:水平平板、(管式),获得pH梯度人工pH梯度:不稳定，可用于制备自然pH梯度载体两性电解质：一系列pI不同的多氨基多羧基混合物(合成过程产生连续变化的氨基羧基比)不同pH范围NH2-R-COO-NH2-R-COOHNH3+-R-COOH,-高pH电极液,+低pH电极液,高pI不同pI混合物低pI高pH两性缓冲低pH,等电聚焦支持介质聚丙烯酰胺应用较多避免分子筛作用薄膜-散热与经济加样方式放大作用检测固定脱色：除去两性电解质染色,六、双向电泳2DE,第一次电泳后，在垂直方向再进行一次电泳单向电泳100种蛋白质双向电泳5000-8000种蛋白质(圆点)组合方式：第一向等电聚焦(pI)，第二向SDS-聚丙烯酰胺均匀/梯度胶电泳(Mr分离)为多,I.E.F.and2DGE,/ch2d/,七、蛋白质印记,将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品分离：高分辨电泳技术检测：灵敏、专一的免疫探测技术探针：用化学方法将有识别能力的物质(抗原、核酸等)和酶或同位素、荧光物