《肠道细菌实验》PPT课件

第四次实验课内容1、细菌代谢产物检查（示教）2、肠道杆菌在选择鉴别培养基的生长情况（示教）SS平板、双糖铁培养基3、肥达试验（结果示教）,实验一细菌代谢产物检查,细菌具有不同的代谢酶系统，因此对营养物质的利用与分解能力也各不相同，可形成不同的中间代谢产物与终末代谢产物。根据细菌的代谢能力及其产物不同鉴别细菌，称为细菌的生化反应。本实验通过介绍常用生化反应的经典试验方法，以了解细菌生化反应的机制与实验原理。,原理：,染色镜检普通琼脂平板中菌落的形态,不能鉴别,能够鉴别,实验一细菌代谢产物检查,细菌代谢产物,分解代谢产物,合成代谢产物,生化反应,?,细菌菌落的色素观察,金黄色葡萄球菌：产生只局限于菌落的脂溶性金黄色色素。铜绿假单胞菌：产生带荧光的水溶性色素，该色素可扩散至菌落周围，使培养基呈亮绿色。,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,细菌菌落的溶血现象观察,乙型溶血性链球菌:透明的无色溶血环。,一、糖发酵试验,1.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。2.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。,基本原理,糖发酵试验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；痢疾杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；乙型副伤寒杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。,基本原理,酸的产生可利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫Ph5.2（黄色）-6.8（紫色），当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。,糖发酵试验：,葡萄糖发酵试验：,四、操作步骤,1、编号用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。2、接种取盛有葡萄糖发酵培养基的试管3支，分别接种大肠杆菌、痢疾杆菌、乙型副伤寒杆菌。另取乳糖发酵培养基试管3支，分别接种这三种细菌。3将上述已接种的葡萄糖和乳糖发酵试管和对照管置37温室中培养24小时。,图1糖类发酵试验,观察结果:,观察结果时，看各管颜色变化及杜氏小管有无气泡。产酸产气用“”表示；只产酸不产气用“+”表示；不产酸也不产气用“”表示。,二、靛基质（吲哚）产生试验(I)原理：分解蛋白胨内的色氨酸形成靛基质（无色）靛基质与靛基质试剂中的对二甲基氨基苯甲醛结合而显红色(玫瑰吲哚)材料：蛋白胨水培养基（氯化钠、蛋白胨、蒸馏水）,方法：约0.3ml的靛基质试剂徐徐加入细菌蛋白胨水培养物注：加入吲哚试剂后切勿摇晃结果：大肠杆菌()红色痢疾杆菌()黄色乙型副伤寒杆菌()黄色,红色吲哚,大肠杆菌,产气杆菌,分解,六、硫化氢产生试验原理：材料：醋酸铅培养基（普通琼脂培养基、硫代硫酸钠溶液、醋酸铅溶液）,含硫氨基酸,硫化氢,遇铅盐或亚铁盐,黑褐色沉淀,方法：结果：乙型副伤寒，黑褐色大肠埃希菌，不变色,乙型副伤寒,大肠杆菌,（21）半固体培养基(动力试验),大肠埃希菌志贺菌伤寒沙门菌,材料：1、EMB培养基、SS琼脂平板、双糖铁培养基2、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌,选择培养基,肠道杆菌在选择鉴别培养基的生长情况,鉴别培养基,SS培养基（SalmonellaShigellaAgarMedium）,原理：（SS平板）非致病菌：,致病菌：,不分解乳糖，菌落呈透明无色；枸橼酸铁能指示硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色,注意：非致病菌并非被杀灭，故挑病原菌菌落时，尽量挑取菌落中心部分,大肠埃希菌,痢疾志贺菌,大肠埃希菌与伤寒沙门菌,双糖铁培养基（DoublesugarIronMedium）成分含酚红指示剂的pH7.6的蛋白胨水500mL琼脂(1.3%)6.5g乳糖(1%)5g葡萄糖(0.1%)0.5g硫酸亚铁铵(0.02%)0.1g硫代硫酸钠(0.02%)0.1g用途初步鉴别肠道杆菌,原理：只分解葡萄糖：产少量酸上层培养基的酸+O2CO2+H2O蛋白胨代谢产物下层培养基不接触空气培养基呈酸性显黄色葡萄糖、乳糖都分解硫酸亚铁铵：用以检查细菌分解蛋白质后是否产生硫化氢。,只产酸产酸&产气,培养基略变碱,指示剂变红,肠道杆菌的生长结果,SS双糖铁大肠埃希菌粉红色大菌落黄色痢疾志贺菌无色细小上红下黄半透明菌落伤寒沙门菌无色细小上红下黄半透明菌落黑色沉淀,检测试剂的成分,病人体内的反应,伤寒或副伤寒病人,O抗原H抗原,含有伤寒沙门菌O抗原伤寒沙门菌H抗原甲型副伤寒沙门菌H抗原乙型副伤寒沙门菌H抗原,肥达试验（Widaltest）,材料,伤寒沙门菌O、H菌液，甲型副伤寒沙门菌H菌液和乙型副伤寒沙门菌H菌液。生理盐水和患者血清（1:20稀释），微量反应板，1ml吸管，52水浴箱,方法,取46孔反应板，孔横向4排，纵列6列，依次编号。于第2、3、4、5、6列每孔内加入生理盐水0.2ml。于第1、2列在每孔内加入稀释度为1：20的受检血清0.2ml，从第2列开始进行倍比稀释。每排加入诊断菌液0.2ml轻轻振荡混匀后，水浴箱孵育2小时,弃去0.2ml,效价的判定,结果观察,+清澈透明，菌体形成凝块于管底+较透明，大部分菌体形成凝块于管底+稍浑浊，较多细小凝集+较浑浊，有细小凝集浑浊，无凝集血清凝集效价：(抗体滴度)与定量Ag产生明显凝集（+）的血清最高稀释倍数,参考值伤寒杆菌凝集价H1：160，O1：80；副伤寒凝集价A1：80，B1：80，C1：80,临床意义机体感染伤寒、副伤寒杆菌后会产生相应抗体，正常人因隐性感染或预防接种，血清中可含有一定量的抗体。一般当H1：160，O1：80，副伤寒凝集价1：80时，才有诊断意义。病程中应每周复查一次，如病人H与O的凝集价均高于参考值或较原凝集价升高4倍以上，则患伤寒的可能性很大。若H凝集价高而O低于正常值，则可能是以往预防接种疫苗的结果或非特异性回忆反应所致。,O抗原沙门菌属间有交叉反应IgMH抗原种特异性-伤寒沙门菌IgG甲型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌,结果分析,O与H抗体的诊断意义,O抗体：IgMH抗体：IgG,一般认为O抗体效价在1：80以上，H抗体效价在1：160以上，有辅助诊断意义。但在分析结果时，应注意以下两点：（1）非肠热症患者，由于曾接种过伤寒，副伤寒疫苗或以往在流行区有过隐性感染或患过伤寒，副伤寒，以及回忆反应等原因，也可呈现阳性结果。不过，由这些原因所引起的阳性反应主要是H抗体升高，O抗体效价一般不高，同时，每隔57天试血一次，其抗体效价一般不会随病程而升高。上述这些都