分子克隆载体的选择.ppt

第八节分子克隆载体的选择,1.选择克隆载体的几个重要参数1）实验对象2）实验性质3）载体容量4）合适克隆位点5）载体的稳定性6）载体DNA制备的难易7）外源基因表达产物产量、产物特点等2.实验对象1）供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式(包括人为的方法)，DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。,常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如：E.coliDH5:F,endA1,hsdR17(rk,mk+),supE44,thi,recA1,relA1,gyrA96E.coliDH5:F,endA1,hsdR17(rk,mk+),supE44,thi,recA1,relA1,gyrA96;80dlacZM15,(lacZYA-argF)U169E.coliDH5F:F,endA1,hsdR17(rk,mk+),supE44,thi,recA1,relA1,gyrA96,80dlacZM15,(lacZYA-argF)U169i.三者均有限制-修饰系统和重组基因缺陷，外源DNA可存活，且不发生重组ii.DH5和DH5F都具有一个可供遗传标记lacZ检测的遗传背景iii.DH5F可供M13mp系列载体配套使用，M13病毒的感染需要F的存在,3.实验性质分子克隆的一般程序包括以下几步：i.分离供体DNA或RNA（mRNA）和载体DNA.构建基因文库或cDNA文库.目的基因或cDNA克隆的筛选.目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等.基因表达与调控机理的研究,1)建立文库用载体常在E.coli进行i.目的基因与供体基因大小小质粒载体，操作方便，鉴定简单大或cos质粒载体,甚至P1或pYAC载体(为减少文库规模，即使基因组小的也可用和cos载体）ii.筛选方法)互补法：可表达,选一般载体;不表达，选表达载体(外源基因必须表达，表达产物必须具备活性)免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性)杂交法：各种载体均可2)目的基因的鉴定次克隆：选用质粒载体，限制酶谱分析，基因结构分析等定序：定序载体（M13mp系列），其他质粒载体（如pUC系列，pBR322，T3，T7，SP6启动子载体）3)基因表达与调控外源基因可表达普通载体;不表达表达型（分泌）载体,4.载体容量M13mp载体4kb细菌质粒载体10kb载体23kbcos质粒载体48kbP1载体95kbpYAC载体1000kb5.合适的克隆位点单克隆位点和多克隆位点,第九节分子克隆载体的组建,构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点，克隆位点，标记基因，载体容量等。1.克隆位点的建立1)体外重组i.减少限制酶识别位点ii.增加限制酶识别位点：人工接头，匹配接头2)体内重组或突变i.减少限制酶识别位点体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建pSUPV系列载体时，去除Kanr基因中的HindIII位点就采用了以下技术路线：培养有pNG35的大肠杆菌细胞提取质粒DNA用HindIII完全酶切转化大肠杆菌再提取质粒DNA再酶切，再转化，直至提取单菌落质粒DNA已无法用HindIII酶切为止,ii.增加限制酶识别位点M13mp系列载体构建中EcoRI位点的建立体外诱变体内错配体外筛选-肽链ThrMetIleThrAspSerM13mp正链5ATGACCATGATTACGGATTCACT3CH3互补链负链3TACTGGTACTAATGCTTAAGTGA5M13mp正链5ATGACCATGATTACGAATTCACT3-肽链ThrMetIleThrAsnSer,2.标记基因的建立1）启动子2）编码区密码子偏爱性，基因产物适用范围3）终止子3.载体容量尽可能除去无关的DNA序列。,第二章练习题1当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的Hind克隆位点后，重组质粒仍可转化E.coli(CmlsTcs)为CmlrTcr，为什么?可设计什么实验证明其假设?2当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落，兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果?可设计何种实验证明你的解释是正确的?3当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化E.coli细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类，即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样，从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却,不能用限制酶回收该片段。当把同类转化细胞培养液所分离到的DNA进行复性分析时，DNA分子间不会发生复性，但把从不同类转化细胞培养液分离到的DNA进行同样的实验时，发现在电镜下可观察到十分类似于8字形的结构。如何解释上述实验结果?可利用图示法解释。4.由于分子克隆载体的大小决定外源DNA插入片段的大小，两者呈反比关系，因而在建立载体时千方百计地减小载体分子量。对于穿梭载体，因为复制起点和标记基因具有生物特异性，所以载体上需要同时具有两个以上的复制起点和标记基因。已知不同生物的某些基因启动子可以在E.coli细胞中启动基因转录，问可以采取一些什么方法减小穿梭载体的分子量?5.丝状真菌的分子克隆载体绝大多数都是整合型的。当用丝状真菌突变体作为宿主菌和利用遗传互补法筛选基因时，常常会遇到无法回收到阳性克隆中的基因片段的问题。有的科学家利用或cos质粒载体构建文库，然后利用重组分子转化宿主菌，在所获得的阳性克隆中，可用一简单的方法获得所需基因，他是采用何种方法获得该基因的?,6为了弄清leu2基因的突变位点，一研究生将YIp(含LEU2基因)质粒转入酿酒酵母(Leu-)，然后在无亮氨酸的合成培养基上分离到Leu+转化子，经各种实验证明该质粒已整合到leu2基因旁边，最后他用一种非常简单的方法就将leu2基因分离出来了。他是用何种方法分离该基因的?可用何种方法证明该基因是突变基因?画出整个设计图（已知酵母的LEU2基因可与具leuB的E.coli突变体发生遗传互补）7当YIp整合到染色体DNA中后，偶尔还会发生再次重组，导致突变基因被野生型基因所取代，现已知有两个转化体分别属于上述两种情况，可用何种方法区别这两种不同的转化体?8当YRp质粒转移到酵母细胞后，有时也会发生整合现象，即这种自主复制是质粒可插入到染色体DNA中，现有一个含URA3的YRp质粒，可用何种方法筛选到这种整合型的转化体?如何证明?,9.有些用于转化的酵母菌株也可发生回复突变，当把YRp质粒转入酵母细胞后，在选择性培养基上生长的大多数为转化体，极少数为回复突变体。现分离到一个菌落，怀疑它为回复突变体，可用什么方法证明此推断?为避免回复突变体的出现，应选择何种受体菌?10.可用何种方法使酵母菌株中的天然质粒消除?简要描述其实验设计，并写明可用什么方法证明其质粒被彻底消除?11.现有一BamHI