PCR体系优化(新)PPT课件

精选,1,荧光PCR体系的优化及多色荧光PCR,程扬健,厦门大学生命科学院分子诊断实验室,精选,2,精选,3,什么是Ct值和Rn？,Ct值中的C代表循环数（Cycle），t代表域值（threshold），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Rn:相对荧光强度,精选,4,为什么用Ct值定量而不用终点相对荧光强度定量,精选,5,实时荧光PCR是如何定量？,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,在一定范围:Ct值,精选,6,PCR检测过程,RealtimePCR,精选,7,实时荧光定量PCR优化目标,3、R值,精选,8,优化内容,引物设计和筛选探针设计和筛选反应体系的优化反应程序的优化,HCV,分子信标,精选,9,引物的设计与筛选1,序列查找与比对,精选,10,附：主要数据库的网址,精选,11,二级结构分析,条件：42；50mMNa+;2.5mMMg2+,/zukerm/rna/,引物的设计与筛选2,精选,12,HCV5UTR,精选,13,引物筛选结果,引物的设计与筛选4,精选,14,引物用量的优化,不对称PCR（S/A=1：4）Vs对称PCR（S/A=1：1）,引物的设计与筛选5,精选,15,探针设计和筛选1,探针设计,精选,16,探针设计和筛选2,探针的Tm值,精选,17,探针设计和筛选3,退火温度的确定,精选,18,探针用量的优化,探针设计和筛选4,精选,19,不同TaqE的比较,Taq1,Taq2,反应体系的优化1,精选,20,TaqE浓度的优化,0.5U/T,1.0U/T,2.0U/T,3.0U/T,反应体系的优化2,精选,21,dNTP浓度的优化,反应体系的优化3,精选,22,Mg2+对荧光强度的影响,精选,23,Mg2+和退火温度的优化-(方阵法）,精选,24,PCR促进剂的影响,精选,25,AMV与M-MLV的比较,精选,26,M-MLV的用量的优化,精选,27,高浓度RNA,低浓度RNA,比较了四个浓度：24U/T12U/T8U/T4U/T,RNA酶抑制剂浓度的优化,精选,28,优化前后含量对比,精选,29,逆转录时间的比较,逆转录时间（30min；45min；60min）,反应程序的优化,精选,30,RT-PCR扩增程序优化,RT-PCR扩增程序（优化前）,42度，60分钟,95度，3分钟,95度，30秒,55度，20秒,逆转录,预变性,延伸,RT-PCR扩增程序（优化后）,42度，45分钟,95度，3分钟,95度，10秒,58度，45秒,逆转录,预变性,50个循环,45个循环,72度，20秒,退火,变性,退火延伸,反应程序的优化,变性,精选,31,优化前后的比较,优化后,优化前,精选,32,多色荧光PCR,双色荧光PCR三色荧光PCR多色荧光PCR,精选,33,多色荧光PCR的特点,高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体.系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.经济性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.,精选,34,双色荧光PCR,FAM,JOE