基因工程的基本操作程序[1].ppt

专题1基因工程,1.2基因工程的基本操作程序,概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。特点：基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性，并通过工程化手段为人类提供有用的产品及服务。,基因工程,核糖体,基因的结构,（原核细胞）,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质,不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质,非编码区：,编码区,真核细胞的基因结构,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA,内含子:,外显子:,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定,基因的直接分离或人工合成。即获取含有所需要的完整的遗传信息的DNA片段。,从基因文库中获得目的基因,利用PCR技术扩增目的基因,第一步：获取目的基因,从基因文库中获得目的基因,将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体菌的不同细胞中去，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,含有一种生物的全部基因,含有一种生物的部分基因,构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,从基因文库中获得目的基因,基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因的翻译产物蛋白质,如何从基因文库中获得目的基因,利用PCR技术扩增目的基因,条件：已知目的基因的核苷酸序列过程：变性、退火、延伸、多次重复,人工合成基因法,DNA合成仪,直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。,逆转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。,1、能在宿主细胞内复制并稳定的保存2、具有多个限制酶切点3、具有某些标记基因4、对受体细胞无害,第二步：基因表达载体的构建,目的基因与运载体结合,用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在DNA连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,基因表达载体的构建,基因表达载体的组成：目的基因启动子终止子标记基因基因表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中存在，并且遗传给下一代；使目的基因表达和发挥作用启动子：位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录产生mRNA终止子：位于基因的尾端。终止转录标记基因：检测受体细胞是否含有目的基因,第三步：将目的基因导入受体细胞,通过运载体把目的基因带入某生物体内，并使目的基因在受体细胞内能准确地转录和翻译。,为使重组的DNA分子更容易进入受体细胞，通常要用CaCl2对受体细菌进行处理，使受体细菌具有更大的通透性。,农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法,将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,农杆菌转化法,农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力；Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。转化:目的基因插入TDNA农杆菌导入植物细胞稳定维持和表达,方法：显微注射技术操作程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射体内发育新性状动物,将目的基因导入动物细胞,原核生物特点：繁殖快、单细胞转化：Ca2处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,将目的基因导入微生物细胞,常用方法分子杂交技术DNA和DNA分子之间的杂交DNA和RNA分子之间的杂交蛋白质分子（抗原抗体）之间的杂交,第四步：目的基因的检测与鉴定,（1）DNA和DNA分子之间的杂交,第一步，将受体生物DNA提取出来，经过适当的酶切后，走琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的片段分开；第二步，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；第三步，用标记了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；第四步，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；第五步，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明受体植物染色体DNA上有目的基因。,（2）DNA和RNA分子之间的杂交,它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法，具体做法与（1）相同，只是第一步从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA，杂交带的显现也与（1）相同。,（3）蛋白质分子（抗原抗体）之间的杂交,第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。,第四步：目的基因的检测与鉴定,将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,思考与探究,农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。,需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,基本操作如下：（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2